研究背景： 原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是全世界常见的恶性肿瘤之一，以肿瘤细胞增殖能力强、全身转移快以及疾病早期缺乏特异性临床症状为特点，预后较差。传统抗肝细胞癌药物治疗效果差，手术治疗5年生存率也仅50％，有必要探求新的有效的抗肝细胞癌的生物治疗手段。全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者约20亿人，资料显示HBV慢性感染是原发性肝细胞癌发生的主要危险因素，但HBV致癌的具体机制尚不很清楚。 乙型肝炎病毒X基因编码的X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是HBV感染和复制过程中必须的多功能病毒蛋白质，并可能直接诱导肝细胞癌变。Koiko等将X基因转入CD-1小鼠胚胎细胞，84％小鼠肝脏发生了肿瘤并伴有HBx的高表达。在HBV相关的肝细胞癌组织中，HBx的表达明显升高，但HBV的其他蛋白未见明显升高。近年来也有研究表明HBx与肝癌细胞转移及肝癌组织中的血管形成有密切关系，这些都为HBx诱导肝细胞癌变提供了直接的证据。因此，本课题以HBV X基因为靶点，采用RNA干扰(RNAi)技术特异性阻断X基因的转录表达，研究其能否抑制肝癌细胞生长，以探讨肝细胞癌的生物治疗新方法；同时也进一步阐明HBx蛋白诱发肝细胞癌变的机制。 对比正常的肝组织，原发性肝细胞癌组织及肝脏癌前病变组织中p16INK4A、SOSC-1及APC基因甲基化明显升高，并且抑癌基因启动子区域CpG岛异常甲基化导致p16INK4A等抑癌基因失活是肝细胞癌变的重要机制之一。5-氮-2’-脱氧胞苷可以结合进细胞DNA中，特异性抑制DNA甲基转移酶的活性，使普遍存在的DNA甲基化降低。2006年美国食品药品监督局批准5-氮—2’—脱氧胞苷作为特异性的DNA甲基转移酶抑制剂用于治疗与DNA甲基化有关的骨髓增生异常综合症，这为研究5-氮—2’—脱氧胞苷作为肝癌的治疗手段提供了新的思路。 为寻求HBV相关肝细胞癌的生物治疗手段，本课题研究靶向HBV X的siRNA和甲基化抑制剂5-氮-2’-脱氧胞苷单独或联合使用对肝癌细胞及裸鼠肝癌移植瘤生长的作用并探讨HBx蛋白诱发肝细胞癌变的可能机制。 研究目的： 1、明确靶向HBV X的siRNA和甲基化抑制剂对HBV相关肝癌细胞生长的抑制作用及机制，以探讨肝细胞癌的生物治疗手段。 2、探讨HBx蛋白诱发肝细胞癌变的可能机制。 实验方法 以稳定表达GFP/HBV X融合蛋白的HepG2细胞系(HepG2/GFP—HBx细胞)和稳定表达GFP的HepG2细胞系(HepG2/GFP细胞)作为本课题的实验系统。设计合成靶向adr亚型HBV X基因的小分子干扰RNA(X—siRNA)及无关序列对照siRNA。用X—siRNA及5-氮—2’—脱氧胞苷(5-aza—dC)单独或联合处理HepG2/GFP—HBx细胞，RT—PCR法测定siRNA处理细胞的HBV X基因表达；MTT法检测HepG2/GFP、HepG2/GFP—HBx及各处理细胞的生长。分别将HepG2/GFP、HepG2/GFP—HBx细胞接种于裸鼠皮下，观察两组裸鼠皮下移植瘤生长情况；进一步将HepG2/GFP—HBx细胞(1.0×107个/ml，0.2ml/只)接种于裸鼠右侧背部皮下建立移植瘤，待皮下移植瘤长至约4×4mm大小时随机分成5组并相应处理，分别为X—siRNA处理组(移植瘤局部注射X—siRNA，1.25μg/g与脂质体混合，每天1次，连续2天)、5-氮—2’—脱氧胞苷组(生理盐水稀释腹腔注射1.5μg/g每天1次，连续3天)、X—siRNA和5-氮—2’—脱氧胞苷联合用药组；对照组(生理盐水腹腔注射每天1次，连续3天)及对照siRNA组(移植瘤局部注射无关序列siRNA，1.25μg/g与脂质体混合，每天1次，连续2天)，观察处理后皮下移植瘤的生长情况。甲基化PCR检测各组细胞及移植瘤组织标本p16INK4A基因甲基化。Western blot检测各组细胞p16蛋白水平。采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，根据方差齐性检验结果，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。 实验结果： MTT检测示HepG2/GFP-HBx细胞生长较HepG2/GFP及HepG2细胞明显加快(n=5，p<0.05)；RT—PCR显示X—siRNA处理的细胞HBV X mRNA水平明显降低；裸鼠皮下移植瘤实验显示HepG2/GFP—HBx组的皮下移植瘤体积明显大于HepG2/GFP组(p<0.05)；X—siRNA与5-aza—dC处理的肝癌细胞生长较对照组减慢(p<0.05)，其移植瘤体积明显小于未处理组(p<0.05)，但两者联合较单药处理无明显差异。甲基化PCR检测示HepG2/GFP—HBx细胞存在p16INK4A甲基化而HepG2、HepG2/GFP细胞未检出甲基化；X—siRNA和5-aza—dC处理的细胞及移植瘤组织中p16INK4A基因甲基化减低。Western blot分析示HepG2/GFP—HBx细胞p16蛋白水平低于HepG2、HepG2/GFP细胞，而X—siRNA和5-aza—dC处理细胞的p16蛋白水平高于未处理细胞。 结论： 1、HBx蛋白能够促进肝癌细胞生长。 2、HBx蛋白能诱导p16INK4A基因甲基化而抑制p16蛋白表达；HBx蛋白促进肝癌细胞生长的作用可能与其对p16蛋白表达及功能的抑制有关。 3、靶向HBV X的siRNA及甲基化抑制剂能够有效抑制肝细胞癌生长，其机制可能是HBV X的siRNA及甲基化抑制剂逆转了HBx诱导的p16INK4A基因甲基化而恢复p16蛋白表达及功能。