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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业的病原。PRRSV非结构蛋白10(Nsp10)具有解旋酶活性,与病毒的复制密切相关。本实验室的前期工作发现在PRRSV高致病性毒株JXwn06感染的细胞内存在Nsp10全长(Nsp10)和截短体(Nsp10a)两种亚型,围绕这一现象,我们以高致病性毒株(JXwn06)和低致病性毒株(HB-1/3.9)为研究对象,利用点突变和反向遗传技术解析PRRSV Nsp10a产生的分子基础及意义,为阐释Nsp10不同亚型在PRRSV增殖中的作用提供理论依据。首先以原核表达的Nsp10蛋白免疫小鼠,获得了一株抗Nsp10蛋白的单克隆抗体,其识别的抗原表位286AIQPDYRDKL295在基因2型PRRSV毒株间高度保守,而在基因1型毒株中存在变异,该单抗可以区分基因1型和基因2型PRRSV毒株。以该单抗为一抗对PRRSV感染细胞进行IFA和Western Blot检测,发现病毒感染后12 h即可检测到Nsp10蛋白,且主要分布于细胞核周围;JXwn06感染可产生Nsp10和Nsp10a,而HB-1/3.9感染只产生Nsp10。通过质谱鉴定和截短表达,确定与Nsp10相比,Nsp10a的氨基酸序列包含78-Thr和423-Arg,并且Nsp10a可能在N端缺失70多个氨基酸。为探究Nsp1Oa亚型产生的分子基础,分别以JXwn06和HB-1/3.9为骨架,互换Nsp10基因或同时互换Nsp9和Nsp10基因,构建出4株嵌合病毒。与其亲本毒不同,RvHJn10和RvHJn9n10感染可以产生Nsp10a,而RvJHn10和RvHJn9n10感染只产生Nsp10,说明Nsp10本身决定Nsp10a产生与否。将JXwn06与HB-1/3.9 Nsp10蛋白的差异位点进行一系列点突变,拯救相应的病毒,结果表明Nsp10第69位氨基酸Glu是影响Nsp1Oa产生的关键氨基酸。为验证蛋白酶Nsp2或Nsp4是否可以剪切Nsp10,体外共转Nsp10和Nsp2或Nsp4,结果表明Nsp10和Nsp2存在相互作用,但Nsp2不能剪切Nsp10, Nsp4也不能剪切Nsp10。通过添加蛋白酶抑制剂MG132,证明Nsp10a的产生与蛋白酶体途径无关;通过分析RvJX-E69G和RvHB-G69E及其亲本拯救毒的增殖曲线,发现在MARC-145细胞和PAMs上,Nsp1Oa的产生对PRRSV的增殖没有显著影响。综上,本研究制备出一株可以区分基因1型和基因2型PRRSV的Nsp10单抗,鉴定出该单抗识别的线性B细胞表位;证实Nsp10第69-Glu是影响Nsp10a产生的关键氨基酸;确定Nsp10a的产生与蛋白酶体途径无关,且对PRRSV的增殖没有显著影响。研究结果为进一步解析高致病性PRRSV毒力增强的分子机制提供了有力工具和科学数据。