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研究背景和目的:随着骨关节疾病患者不断加速增加,关节置换手术的需求越来越广泛,接受人工关节置换术的患者数量也呈逐年增长的趋势。假体周围磨损性骨溶解是全关节置换术后最常见的远期并发症,常导致假体周围无菌性松动(aseptic loosening),10%的患者,10年内常因假体无菌性松动导致关节失去功能。目前,临床上双磷酸盐、雌激素、狄诺塞麦等药物已广泛应用于关节置换术后,但这些药物的均具有很大副作用。生物材料和假体设计方面已经有了很大的进展,经过改进增加假体的耐磨性,假体从金属到高耐磨全陶瓷假体的使用,一定程度上缓解了假体的磨损,但同时陶瓷假体也有脆和价格昂贵的缺点限制了其广泛使用。所以骨溶解导致的假体松动仍然是关节置换手术后最难克服的问题。假体周围产生的钛颗粒等磨损颗粒诱发的骨溶解被认为是导致关节置换失效的主要原因之一。RANKL促进骨髓来源的单核巨噬细胞(BMMs)分化成破骨细胞和骨吸收导致假体周围骨量丢失。因此破骨细胞在介导磨损颗粒引起的骨溶解破坏中起着关键作用,是药物干预的主要靶点破骨细胞是骨组织成分的一种,主要行使骨吸收功能,在骨溶解过程中起着关键作用。破骨细胞起源于血系单核-巨噬细胞系统,是一种特殊的终末分化细胞,它可由其单核前体细胞通过多种方式融合形成巨大的多核细胞。破骨细胞研究人员发现在翻修假体周围存在大量的单核巨噬细胞及成熟的破骨细胞,因此有必要寻找能够抑制破骨细胞的分化和骨吸收功能的药物来治疗和预防假体周围骨溶解。ERK信号通路与破骨细胞生存,增殖,凋亡,形成密切相关,其中ERK1在调节破骨细胞分化,迁移和骨吸收中起关键作用。Vx-11e是一个ERK信号通路的高效选择性的小分子抑制剂,在本次研究中,我们发现Vx-11e能够有效抑制破骨细胞的分化和骨吸收,以及在钛颗粒诱导的小鼠骨溶解模型中起保护作用。实验方法:(1)体外实验:1)为探究Vx-11e对破骨细胞分化和骨吸收功能的影响,我们从小鼠胫骨中提取出骨髓单核巨噬细胞(bone marrow macrophages,BMMs)。在核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导的BMMs向破骨细胞分化的实验中加入不同浓度的Vx-11e,5天后分化出成熟破骨细胞,4%多聚甲醛固定并用抗酒石酸染色(TRAP)染色观察破骨细胞,在镜下统计破骨细胞(细胞核≧3个)的数量,根据统计结果分析Vx-11e对破骨细胞生成、分化的影响。为排除Vx-11e对细胞的毒性作用,利用CCK8试剂盒检测BMMs的增殖实验。2)为进一步显示破骨前体细胞融合受损,在电镜下观察破骨细胞肌动蛋白环(F-actin环)形成和细胞核融合情况。由于,F-actin环在破骨细胞骨吸收功能中其重要作用,下一步用羟基磷灰石96孔板探究Vx-11e对破骨细胞骨吸收功能的影响。3)在不同浓度的Vx-11e干预和RANKL的诱导下BMMs分化成破骨细胞并提取RNA,通过Real-time PCR检测破骨细胞特异性基因的表达情况。利用Western blot实验方法探究Vx-11e抑制RANKL诱导下BMMs破骨细胞分化的相关信号通路包括MAPK和NFκB通路。(2)体外实验:模仿人体内关节置换术后假体周围骨溶解的机制,建立小鼠颅盖骨钛颗粒诱导骨溶解(Ti)模型:6周龄大雄性C57小鼠随机分成4组,空白对照组,Ti组(注射生理盐水),Ti+Vx-11e高剂量组,Ti+Vx-11e低剂量组,隔天注射Vx-11es,2周后收集小鼠颅盖骨,Micro-CT扫描和组织形态学分析实验结果。结果:(1)体外实验:1)Vx-11e能浓度依赖性抑制RANKL诱导下破骨细胞的分化,并且对破骨前体细胞无毒性,Vx-11es通过抑制F-actin环的形成抑制破骨细胞骨吸收功能。2)Vx-11e通过抑制ERK的激酶活性及其下游蛋白抑制破骨细胞分化,并抑制破骨细胞特异性基因MMP9、Ctsk、CTR和ACP5的表达。(2)体内实验:Vx-11e通过抑制破骨细胞的形成和骨吸收功能,能够有效防治钛颗粒诱导的小鼠模型颅盖骨骨溶解。结论:Vx-11e通过抑制ERK的激酶活性抑制破骨细胞分化和骨吸收功能,从而保护钛颗粒诱导的骨溶解。