实验背景气道上皮是呼吸系统对抗有害刺激的第一道防线,各种病原微生物在机体抵抗力低下时均可引起肺部感染性疾病。其中以革兰阴性菌细胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)为主要致病因素,不仅引起肺部炎症反应,还可使原有肺部疾病发展和加重。气道上皮在致病因素的攻击下受到损伤,随后启动自身修复机制。LPS致气道上皮细胞损伤后,可促使细胞发生坏死、凋亡和分泌前炎症因子等反应,这些反应共同推动肺损伤的发展过程。大量研究证明,核因子-κB (nuclear factor, NF-κB)信号途径参与调节细胞生长、分化、增殖、存活、凋亡及炎症反应过程中多种基因的转录,与LPS引起的肺损伤密切相关。然而,LPS导致肺部炎症反应的分子机制还远未阐明。NF-κB在正常情况下与其抑制蛋白ⅠκB结合以无活性的形式存在于静息细胞胞浆中。外界刺激可引起ⅠκB被迅速磷酸化、泛素化而降解,从而释放NF-κB活性亚单位转位入核,激活下游靶基因转录。P120-catenin(p120)是连环素家族成员,可在细胞膜上与上皮钙粘蛋白(E-Cadherin, E-Cad)相互结合而调节细胞粘附。近年来有研究表明,p120通过调节NF-κB活性参与表皮炎症反应。我们推测在气道炎症反应中,p120也可能通过NF-κB信号途径发挥调节作用。实验目的本实验使用脂多糖刺激建立体外气道炎症反应模型,初步探讨脂多糖刺激后气道上皮细胞中p120的表达变化及其对NF-κB信号通路的影响,从而进一步分析气道炎症发生发展的机制。实验方法使用脂多糖刺激建立体外气道炎症反应模型；采用免疫荧光共聚焦成像、Western blot、核浆分离方法检测p120、NF-κB、IκBα等蛋白表达及定位变化；采用荧光定量PCR、定量酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IL-8表达变化；采用荧光素酶报告基因分析的方法检测NF-κB的活性；通过瞬时转染及小干扰RNA技术改变细胞中p120的表达量再检测p120对NF-κB信号途径的影响。实验结果(1)细胞瞬时转染NF-κB报告质粒后,报告基因分析结果显示,LPS刺激可引起气道上皮细胞中NF-κB信号的活化；同时荧光定量PCR和ELISA结果显示NF-κB靶基因IL-8--一种前炎症因子的表达亦有明显增多。(2)p120在正常气道上皮细胞中含量丰富,而LPS刺激后,其表达迅速下调,早在15 min时即可表现出来。基于以上两点,我们推测在LPS所致气道炎症反应中,p120与NF-κB信号途径可能存在某种联系。接下来,我们先探讨NF-κB信号活化的机制。(3)实验发现,在LPS刺激15 min-30 min时,NF-κB的抑制蛋白IκBα迅速降解至几近消失；其磷酸化形式在正常细胞中几乎检测不到,但在LPS处理15 min-30 min这段时间内含量显著增加,在IκBα恢复正常水平后,p-IKBa又再次消失不见。(4)核浆分离试验及免疫荧光共聚焦结果均显示LPS促使NF-κB活性亚单位p65发生核内转位。结果(3)和(4)表明,LPS在气道上皮细胞中引起的NF-κB活化是通过使IκBa发生磷酸化降解,从而导致p65由NF-κB/IκB复合体中释放并转位入核激活相应靶基因转录。接下来,我们通过对细胞转染p120质粒或小干扰RNA,研究p120对NF-κB信号活化的影响。(5)实验结果显示,过表达p120可以部分抑制NF-κB的活性及IL-8的表达,但免疫荧光及核浆分离结果依然可以观测到p65核转位。(6)小干扰RNA敲低p120的表达后,免疫荧光结果显示,LPS可引起p65更强烈的核染色；同时核浆分离产物的免疫印迹结果也证实阻断p120表达可进一步促进LPS诱导的p65核转位。(7)阻断p120的表达可大大提升NF-κB的转录活性及其靶基因IL-8的表达。实验结论本实验表明：(1)LPS可导致气道上皮细胞中p120表达下调。(2)LPS可诱导气道上皮细胞NF-κB信号的活化及其靶基因IL-8的表达。(3) NF-κB信号途径的活化是通过IκBα的磷酸化降解释放p65入核实现的。(4)过表达p120可部分抑制NF-κB信号的活化；敲低p120能显著促进NF-κB信号的活化。本实验提示：在LPS引起的气道炎症反应中,p120可能负性调节NF-κB信号途径的活化,从而抑制气道炎症反应。实验背景大量研究表明,吸烟可从多个方面损伤气道上皮细胞,更是导致慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支气管源性肺癌发生发展的确切因素。然而,吸烟致气道上皮损伤的具体机制仍未完全阐明。上皮细胞损伤后,立即启动自我修复过程。这是一个步骤繁杂的过程,包括细胞延伸、迁移和增殖。而细胞间粘附的改变表现在损伤修复的初始阶段,因此对细胞粘附的研究显得非常有意义。已有研究证实,IQGAP1参与许多生命活动,是一个多功能蛋白。作为Rho家族GTPases成员Racl和Cdc42的一个重要的效应因子,IQGAP1不仅参与调节细胞骨架,影响细胞粘附、极化和迁移,还可能介导β-catenin/TCF信号的转录活化,从而引起其下游细胞增殖相关基因的表达。有研究显示IQGAP1可能通过P-catenin调节细胞粘附,然而具体机制并不明了。由于IQGAP1可与作为细胞粘附成分和Wnt信号通路成员的β-catenin结合,因此研究IQGAP1在损伤修复中的作用就显得尤为重要。有报导指出,IQGAP1在肺组织中高表达。我们推测IQGAP1在气道上皮损伤修复中可能发挥作用,并探讨其可能机制。实验目的通过建立香烟烟雾提取物(CSE)损伤气道上皮的体外模型,观察IQGAP1在损伤修复过程中的表达及定位变化及其对细胞粘附复合体成员β-catenin的影响,初步研究其对气道上皮损伤修复中细胞粘附改变的影响,并为进一步探讨细胞增殖修复提供依据。实验方法使用CSE建立体外气道上皮损伤模型,首先使用相差显微镜观察气道上皮细胞在CSE刺激下的形态学变化,同时采用MTT方法检测不同浓度下细胞活力的变化。接着应用Western blot、免疫荧光共聚焦成像、免疫沉淀等技术观察CSE刺激后IQGAP1的表达、定位变化及其对细胞粘附复合体的影响。最后通过瞬时转染野生型IQGAP1和小干扰RNA,采用核浆分离等方法检测过表达或敲低IQGAP1对β-catenin的影响。实验结果(1)在相差显微镜下观察,可见培养的气道上皮细胞呈现上皮细胞典型的铺路石状形态,立体感强,微凸起,细胞间连接紧密。在CSE损伤后,细胞伸展扁平,细胞间间隙增宽,伸出突起相接触,更高浓度的CSE致使细胞皱缩变圆,死亡增加。(2)MTT结果显示,低浓度CSE可促进细胞增殖,而高浓度则引起细胞活力降低。(3)采用Western blot和免疫荧光技术,我们发现,CSE促使气道上皮细胞中IQGAP1呈现时间依赖性过表达,且其定位信号由细胞连接处扩散至整个胞浆。更为有意义的是,我们通过免疫荧光和免疫印迹发现IQGAP1可与β-catenin结合,CSE刺激后,这种结合变得更强,而β-catenin与a-catenin的结合锐减。(4)进一步通过使用瞬时转染技术,我们发现IQGAP1过表达不仅可以增加β-catenin在细胞内聚集,还可以促使积聚的β-catenin转位入核。而用干扰RNA阻断IQGAP1的表达后,β-catenin在胞浆内的聚集减少,其入核也受到影响。实验结论本实验表明：(1)CSE可在体外诱导气道上皮细胞过表达IQGAP1。(2)CSE减弱β-catenin与粘附复合体中a-catenin的结合,但加强其与IQGAP1的结合(3)过表达IQGAP1促使β-catenin在胞浆中积聚并进而转位入核。本实验提示：IQGAP1通过与α-catenin竞争结合β-catenin,破坏细胞粘附复合体,从而减弱细胞粘附,启动CSE损伤的气道上皮细胞修复,并促进β-catenin转位入核,为下一步增殖修复损伤做准备。