乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，占女性肿瘤死亡第二位，其发病率逐年增高，人们迫切需要采用新的治疗方法来提高患者的生存率及生存质量。分子靶向治疗在肿瘤治疗中的地位逐渐上升，成为肿瘤治疗的一个热点。目前已有多种分子靶向治疗的药物应用于乳腺癌的治疗或正在临床试验阶段，如赫赛汀（Herceptin）、细胞周期调节蛋白抑制剂、环氧化酶-2（COX-2）抑制剂、蛋白激酶C（PKC）抑制剂等。HER2受体是人表皮生长因子受体家族四成员之一，定位于人类17q21，编码分子量为185kD的氨基酸，命名为P185，具有酪氨酸激酶活性，蛋白从结构上分为胞外区、跨膜区和胞内区，后者具有酪氨酸激酶活性，与表皮生长因子受体具有同源性。HER2的功能是作为生长因子受体在细胞分化、粘附和运动中起作用。Her2基因扩增导致HER2高表达，导致细胞恶性转化见于30％转移性乳腺癌患者和部分卵巢癌，肺癌，胃癌和口腔癌患者。HER2过表达增加肿瘤细胞侵袭、转移的能力，通过启动多种转移相关机制而增加转移能力，包括细胞迁移率，体外侵袭力，Ⅳ型胶原酶活性，也影响某些粘附分子如上皮细胞钙粘蛋白等的合成，从而促进转移。妇女患HER-2阳性肿瘤预后差，复发快。因此，HER2高表达可成为判断上述肿瘤恶性程度的独立预后指标。研究表明HER2表达的高低与乳腺癌的临床诊断、药物的疗效及预后判断关系密切。HER2是治疗乳腺癌及卵巢癌的明确靶点。分子靶向治疗在临床肿瘤治疗方面起重要的影响。赫赛汀（Herceptin）是人源化的HER2胞外段单克隆抗体，代表着治疗女性HER2阳性转移性乳腺癌的重大突破。临床病例单用赫赛汀或与紫杉醇联合用药取得良好治疗效果，并且成为治疗HER2阳性肿瘤的一线用药。赫赛汀在转移性肿瘤中的应用将HER2阳性的地位从不良预后的标志变成良好的治疗成果，并且正在进行的研究将为HER2阳性的转移性乳腺癌提供更多治疗的选择机会。抗体导向治疗可以利用抗体为载体将药物导向肿瘤病灶，提高药物疗效，降低药物的副作用。研究表明，单链抗体片段组织穿透能力强，较易穿透细胞外间隙到达深部的肿瘤细胞。与完整抗体相比，单链抗体的免疫原性较弱，可降低人体抗鼠抗体反应。但是，另一方面，由于单链抗体片段缺乏Fc段，丧失完整抗体的效应功能，难以杀伤靶细胞。因此，研究小型抗体需要使用“弹头”分子，包括高效的药物、毒素、细胞因子等。高活性的“弹头”药物力达霉素（lidamycin，LDM，又称C1027），是从我国湖北省潜江县土壤中分离得到的由一株球孢链霉菌（Streptiomyces globisporus）产生的烯二炔类抗生素，是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。LDM的分子由两部分组成：一部分为烯二炔结构的发色团（AE），具有强烈的细胞毒作用，但不稳定；另一部分为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白（LDP），对发色团的稳定性起保护作用。二者可以拆分与重建，重建的力达霉素与天然状态力达霉素具有相同的活性。Smith在1985年最先将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽能以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术，从此，这一领域得到了发展。噬菌体技术是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术。噬菌体展示通过与特定的靶抗原结合，可以从大的单链抗体库中快速筛选出特异抗体。经过3轮或更多轮的筛选，与抗原有高度亲和力的单链抗体scFv可以被富集。针对数百种抗原的抗体已经从噬菌体展示文库中得到，包括细胞表面标志，肽类激素，其他人类蛋白及碳水化合物等。噬菌体展示技术的优点在于，一旦抗体库建立，就可以用来筛选针对靶抗原的抗体。一个抗体库可以被数千研究者用作无限抗原的克隆抗体的来源。并且筛选的过程非常迅速，可以在2～3周内完成。运用ELISA、Western-blot方法通过免疫检测鉴定筛选抗体的亲和力。通常，这个过程包括亚克隆与表达scFv片段得到大量抗体，是耗时与繁琐的。为了解决这个问题，最近研究者着重研究利用免疫检测和功能研究筛选噬菌体克隆。本研究利用将单链抗体连接在M13噬菌体衣壳蛋白PⅢ的N端构建噬菌体抗体库。本研究主要目的是利用噬菌体展示技术筛选HER2高亲和力的单链抗体，与力达霉素构建具有靶向杀伤HER2高表达肿瘤的强化融合蛋白，有助于乳腺癌、卵巢癌等HER2高表达肿瘤的导向治疗。一、抗HER2噬菌体抗体库构建与筛选本研究利用纯化的HER2胞外段蛋白免疫小鼠，从脾细胞提取mRNA，利用RT-PCR扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）。利用重叠延伸反应（SOE-PCR）将VH、VL用连接肽（Gly₄Ser）₃进行连接，克隆至噬菌粒pCANTAB5E，转染E.coli TG1，得到噬菌体抗体库。以高表达HER2的人乳腺癌细胞SKBR3为抗原进行4轮筛选，得到库容为7.5×10⁷的次级抗体库5F-10。从初级抗体库中随机挑取20个克隆进行菌体PCR，结果显示其中15个克隆有scFv片段插入，克隆效率为75％。BstNⅠ酶切随机克隆提取的质粒，酶切图谱显示多样性，表明抗体库具有多样性。用ELISA法鉴定各单克隆与HER2蛋白结合能力，获得与HER2高亲和力克隆scFv6，经序列分析，此基因全长732bp，编码243个氨基酸序列，通过Blast序列比对，此抗体为鼠源性，与以往报道的任何抗体序列都不相同。二、抗HER2单链抗体与力达霉素强化融合蛋白的构建、表达、纯化及强化融合蛋白活性分析利用基因重组技术将筛选出来的HER2高亲和力抗体scFv6片段克隆至含有力达霉素辅基蛋白基因的重组质粒pET-LDP，构建含有融合蛋白的质粒pET-Fv-LDP，转化到大肠杆菌BL21（DE3）starTM中，IPTG诱导表达带有组氨酸标签肽（His-tag）的融合蛋白HER2（Fv-LDP）。经SDS-PAGE分析，表达产物分子量40kD，主要以可溶形式表达在周质腔中，表达占全菌蛋白的7％，用Ni离子亲和柱进行纯化，1L菌液诱导后可产生约2mg可溶性融合蛋白。然后与力达霉素发色团AE重组，得到强化融合蛋白HER2（Fv-LDM）。研究其免疫学活性及其对HER2高、低表达肿瘤细胞的细胞毒作用。Western-blot分析显示，融合蛋白与纯化的HER2蛋白胞外段有结合活性。细胞ELISA和免疫荧光结果表明，融合蛋白HER2（Fv-LDP）与SKBR3、SKOV3都有较高的亲和活性，略低于商品化HER2单抗L87，而与MCF7无结合力。0.01M，0.1M，1M的强化融合蛋白可降低SKBR3细胞HER2的mRNA与蛋白表达水平。流式细胞周期测定结果融合蛋白将SKBR3细胞周期阻滞于G1期，而强化融合蛋白将细胞周期阻滞于G2／M期。HE染色和Hoechest染色显示，强化融合蛋白可以诱导细胞凋亡。MTT结果显示，强化融合蛋白对HER2高、低表达的细胞都有强烈的杀伤活性，较好地保留了力达霉素的细胞毒作用。在裸鼠皮下移植人乳腺癌SKBR3肿瘤模型中检测强化融合蛋白HER2（Fv-LDM）的体内抗肿瘤活性，接种肿瘤的第10天和17天分别尾静脉给药2次，观察肿瘤体积和裸鼠体重变化。实验结果表明0.2mg／kg，0.3mg／kg，0.4mg／kg三个剂量的强化融合蛋白HER2（Fv-LDM）对人乳腺癌SKBR3裸鼠移植瘤生长都有抑制作用，抑瘤率分别为60％，70％，89.7％。强化融合蛋白HER2（Fv-LDM）0.3mg／kg，0.4mg／kg的抑瘤率与LDM（0.05mg／kg）抑瘤率56.8％相比有显著差异（P＜0.05）。体内实验结果说明，强化融合蛋白可以提高动物对力达霉素的耐受剂量，同时显著改善治疗效果，是具有很好前景的抗体靶向药物。