【摘 要】
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贵金属纳米材料一直是目前生物化学领域的研究热点,其在检测、杀菌、治疗和传感等多种领域均有广泛的应用。其中,铂族元素纳米材料以其突出的性能,更是在催化、药物递送及治疗、光热传感及转化、电信号传感等方面表现优异。锇（Osmium,Os）作为铂族元素的一员,在近年来很少被研究,但仍有研究表明,锇元素组成的单元素或合金纳米粒子都能表现出更优异的类酶活性,因此开发应用锇元素纳米材料的类酶活性是十分具有研究意
【基金项目】
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广州市科技计划项目（201903010034）
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贵金属纳米材料一直是目前生物化学领域的研究热点,其在检测、杀菌、治疗和传感等多种领域均有广泛的应用。其中,铂族元素纳米材料以其突出的性能,更是在催化、药物递送及治疗、光热传感及转化、电信号传感等方面表现优异。锇（Osmium,Os）作为铂族元素的一员,在近年来很少被研究,但仍有研究表明,锇元素组成的单元素或合金纳米粒子都能表现出更优异的类酶活性,因此开发应用锇元素纳米材料的类酶活性是十分具有研究意义的。随着国家开放生育政策的到来,社会上对孕妇和婴幼儿的健康问题也愈发关注,而叶酸检测更是其中很重要的一项指标。作为维生素B族的一员,叶酸（Folic acid,FA）对人体内核酸的合成发挥着重要的作用,叶酸的缺乏会导致神经管畸形以及巨幼红细胞贫血症的发生,严重影响着新生婴儿和孕妇的健康。叶酸摄入过多也会扰乱身体对维生素B12的吸收,甚至会有引发癌症的风险。于此同时,叶酸的检测也不仅仅限于医院的常规检查,在添加叶酸的食品药品行业内的检测也十分必要,因此建立一种高灵敏、准确、即时快速检测叶酸的方法是十分具有发展前景的。本研究首先使用两种方法分别在叶酸的氨基和羧基上连上载体蛋白制备成完全抗原,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）鉴定两种完全抗原的成功制备（包括免疫原和包被原）。其次,使用两种免疫原免疫新西兰大白兔获得两种抗叶酸的多克隆抗体,再对两种包被原和两种抗体两两组合进行评价,结果显示每一种抗体对于异源包被原的分析灵敏度更高,从而筛选出最优的抗体和包被原组合进行后续免疫分析方法的建立。本研究还通过一锅法,成功制备了一种平均粒径在27 nm的纳米绣球花状的锇纳米酶。使用透射电镜（TEM）、能量色散光谱仪（EDS）、X射线电子能谱（XPS）进行表征。同时对其类酶活性进行稳定性研究、催化机理研究和稳态动力学研究,发现其是一种化学和温度稳定性良好、催化效率高、活性保持长久的一种类过氧化物酶,是天然HRP酶的良好替代品。基于锇纳米酶卓越的类过氧化物酶活性以及优选出的抗叶酸多克隆抗体和包被抗原组合,制备成一种锇纳米酶-抗叶酸抗体的检测探针,建立了一种具备双功能的免疫分析方法:利用锇纳米酶-抗叶酸抗体探针上锇纳米酶的类酶活性,代替天然HRP酶在传统酶联免疫分析法（ELISA）分析实验中催化TMB显色,建立了一种准确、灵敏的叶酸定量检测方法（Os NHs-NLISA）,结果显示的叶酸的检测线性范围为9.42～167.53ng/m L,半抑制浓度IC50=39.73 ng/m L,最低检测限LOD=4.03 ng/m L;利用锇纳米酶-抗叶酸抗体探针带有的灰黑色颜色标记,制备成一种免疫层析试纸条,建立了一种检测限低、即时快速的叶酸定性检测方法（Os NHs-LFIA）,显示视觉临界值100 ng/m L,视觉检测限为0.01 ng/m L。两种方法均对叶酸的检测表现出高特异性,同时也能够在奶粉加标样品中检测出叶酸,加标平均回收率为93.9至103.6%,变异系数低于4.9%,通过超高效液相色谱串联三重四极杆质谱联用仪（UPLC-MS/MS）进行方法学验证,结果有高的相关性（R~2=0.999）。综上所述,基于锇纳米酶开发的具备双功能的免疫分析方法模型能够更灵敏、更准确、更高效地用于叶酸检测,有望开发成新型即时检测技术的检测手段。
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