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目的目前，前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)的发病率已跃居我国男性泌尿、生殖系统恶性肿瘤的第三位。对于晚期PCa以及雄激素非依赖型PCa，基因治疗可以作为一种很有前途的治疗手段。Pim-1是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，已有研究显示Pim-1在细胞凋亡、增殖、分化和肿瘤发生过程中起重要作用，并证实其在Pca中有高表达。本研究旨在利用RNA干扰(RNAi)技术下调Pim-1基因的表达水平，研究其对PCa细胞在增殖、凋亡及侵袭等方面的影响，并确定Pim-1基因是否可作为PCa基因治疗的靶基因，进而为PCa基因治疗的临床应用奠定实验基础。方法利用RT-PCR和Western-blot筛选Pim-1表达水平最高的前列腺癌细胞系作为研究对象。利用相关软件设计、筛选出若干Pim-1 mRNA干扰序列，再通过BLAST及干扰靶点mRNA的二级结构进一步筛选出3条靶向Pim-1mRNA的干扰序列，长度均为19nt，分别靶向674-692、707-725和1080-1098位点。人工合成靶向Pim-1基因的siRNA转录模板，与shRNA表达载体相连接，成功构建针对PIM-1 mRNA上述位点的RNAi重组质粒pRNAT-U6．1／Neo-Pim1-shRNA-1，-2，-3。重组质粒在脂质体介导下转染前列腺癌细胞，利用RT-PCR和Western-blot检测Pim-1基因沉默效果，并筛选稳定转染的细胞克隆。利用流式细胞技术检测Pim-1基因沉默对前列腺癌细胞的细胞周期及凋亡的影响，利用Transwell实验检测细胞侵袭能力的变化。同时利用RT-PCR和Western-blot检测Pim-1表达下调后前列腺癌细胞中原癌基因c-Myc表达的变化情况。制备前列腺癌裸鼠移植瘤模型，肿瘤局部注射针对Pim-1基因的RNAi重组质粒和脂质体，观察前列腺癌组织细胞内Pim-1基因的沉默效果及RNAi重组质粒对前列腺癌在动物体内生长的抑制作用。RT-PCR和Western-blot检测中均以GAPDH的表达水平作内参照。结果RT-PCR检测显示3个RNAi重组质粒转染PC-3细胞后Pim-1 mRNA表达的相对量分别为0．324±0．025、0．136±0．013、0．125±0．016，与PBS对照组(表达量为1．078±0．132)相比均明显下降(P＜0．05)。与重组质粒-1相比，RNAi重组质粒-2，-3具有更强的Pim-1基因沉默效应(P＜0．05)。Western-blot检测显示，与PBS对照组相比这2个RNAi重组质粒均可以显著降低Pim-1蛋白的表达水平。将靶向1080-1098位点的RNAi重组质粒-3以脂质体为介导转染PC-3细胞，并筛选出稳定转染细胞。与PBS对照组相比，Pim-1基因沉默PC-3细胞的增殖速度、克隆形成能力及致瘤能力均显著下降，细胞周期中G1期细胞的比例升高而S期细胞的比例降低，说明G1期→S期进程受阻。Pim-1基因沉默对前列腺癌细胞的侵袭能力并无显著影响。而且，Pim-1基因沉默前列腺癌细胞中c-Myc蛋白水平显著降低(沉默组和PBS对照组c-Myc蛋白相对量分别为0．384±0．041和0．866±0．079，P＜0．05)，而其mRNA水平却无明显变化(沉默组和PBS对照组c-MycmRNA相对量分别为0．986±0．158和1．027±0．105，P＞0．05)。与PBS对照组相比，种植瘤组织内注射Pim-1 RNAi重组质粒-3可以有效降低前列腺癌细胞内Pim-1 mRNA水平(Pim-1 mRNA的相对量分别为1．113±0．048和0．437±0．013，P＜0．05)和Pim-1蛋白水平(Pim-1蛋白相对量分别为0．948±0．097和0．378±0．048，P＜0．05)。另外，注射重组质粒可以显著抑制裸鼠皮下种植瘤的生长，重组质粒组和PBS对照组种植瘤的最后重量分别为0．33±0．08g和0．68±0．14g(P＜0．05)。PBS对照组和空质粒对照组在各项指标检测中均无显著差异(P＞0．05)。结论本实验成功构建了针对Pim-1 mRNA的RNAi重组质粒表达载体，并验证了靶向不同位点重组质粒载体的基因沉默效果。重组载体在脂质体的协助下能够高效的转染PC-3细胞，靶向Pim-1 mRNA 1080-1098位点的RNAi重组质粒能够有效的在转录后水平抑制前列腺癌细胞Pim-1基因的表达，并使PC-3细胞的细胞周期受到阻滞，抑制了细胞的增殖，同时诱发细胞凋亡。Pim-1可以在蛋白水平调控c-Myc的表达，对抑制肿瘤生长可能产生协同效应。裸鼠种植瘤模型的动物体内抑瘤实验显示，Pim-1可以作为前列腺癌基因治疗的有效靶点，具有潜在的临床应用价值。