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脑卒中是一种死亡率、致残率、发病率及复发率均较高的疾病,严重威胁着人类健康,也是多年来一直困扰着医学界的难题。脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中,缺血性脑卒中又名脑梗死,在所有脑卒中中占60%-70%,气虚血瘀是其主要证型。近年来关于脑梗死气虚血瘀证的临床和实验研究不断取得进展,但其研究仍不够深入和全面,还有许多问题需要深入探讨。目前用于评价中药治疗作用的动物模型以疾病模型居多,难以客观反映中药作用的特点。病证结合动物模型比较符合中医药研究以及对疾病发生发展规律分析的要求。本课题组前期的研究工作探讨和建立了稳定可靠的脑梗死气虚血瘀证病证结合大鼠模型,研究了模型表征及病理生理的变化,初步发现其能量代谢可能出现障碍。然而其能量代谢变化的特点及机制的研究尚待深入。能量代谢障碍是脑血管疾病的始动因素,AMPK作为能量代谢变化的感受器和效应器,调节机体的能量代谢,在脑血管疾病中有重要作用,可能与气虚血瘀证的生物学基础有关,但这方面的研究和相关报道较少。本研究在前期研究工作的基础上,从能量代谢角度进一步观察脑梗死气虚血瘀证大鼠模型表观、证候、能量代谢及相关因素水平的变化,同时探讨AMPK及其介导的信号通路对模型的影响和益气活血方的干预作用,以期为临床应用和进一步的实验研究提供有价值的理论依据。目的:建立多发性脑梗死气虚血瘀证大鼠模型,观察其能量代谢和相关因素水平的变化,以及AMPK介导的下游信号通路对模型病理生理、证候及能量代谢变化的影响,同时研究益气活血方对模型的干预作用与AMPK及其介导的下游信号通路的相关性,阐明该病证结合模型形成与发展的生物学基础,气虚血瘀证的科学内涵及益气活血方的作用机制,为临床应用和进一步的实验研究提供有价值的靶点和思路。方法:将健康雄性SD大鼠随机分成4组:①假手术组,n=21;②模型组,n=21;③益气活血方组(26g生药/kg),n=21;④二甲双胍组(250mg/kg),n=21。假手术组大鼠正常饲养,不进行任何刺激,其他3组大鼠采用水环境小平台法,每天进行睡眠剥夺16h(每天16:00至次日8:00),睡眠剥夺1周后行多发性脑梗死手术,术后继续睡眠剥夺28天。术后当天两个给药组分别按所述剂量以10mL/kg开始灌胃给药,每天1次,连续灌胃给药28天,假手术组和模型组大鼠分别灌胃等体积蒸馏水。于术后2天(给药2天)和术后28天(给药28天)每组选取10只大鼠进行相关指标检测:第一部分:大鼠一般状态,体重,神经功能缺损评分,抓力,力竭游泳时间,血液流变性,舌面图像RGB值,脉象,脑组织病理形态学;第二部分:采用HPLC法测定大鼠脑皮层ATP、ADP、AMP含量,计算AMP/ATP,TAN,EC;第三部分:采用比色法和生化仪测定大鼠血清和脑皮层葡萄糖、乳酸、丙酮酸、游离脂肪酸含量及乳酸脱氢酶活性,乳酸/丙酮酸比值;第四部分:采用Western Blot法测定大鼠脑皮层AMPK、p-AMPK、ACC、p-ACC、CPT-1蛋白表达水平;采用免疫组化法测定脑组织p-ACC和CPT-1蛋白表达水平。结果:第一部分:①一般状态,假手术组大鼠精神状态良好,外表、饮食、两便及活动均正常;模型组大鼠状态欠佳,精神萎靡不振,静卧懒动,便溏,且随病程发展而加重;益气活血方组大鼠一般状态明显优于模型组。②证候指标,模型组术后2天和28天体重、抓力、力竭游泳时间、脉搏幅度与假手术组比较均明显减少(P<0.01),益气活血方组术后28天体重、抓力、力竭游泳时间、脉搏幅度及术后2天力竭游泳时间与模型组比较均明显增加(P<0.05或P<0.01);与假手术组比较,模型组术后2天和28天舌面图像RGB值均明显减少(P<0.05或P<0.01),在切变率5s-1、60s-1、150s-1下的全血黏度均明显增加(P<0.05或P<0.01),与模型组比较,益气活血方组术后28天舌面图像RGB值明显增加(P<0.05或P<0.01),术后2天在切变率5s-1下及术后28天在切变率5s-1、60s-1下的全血黏度均明显减少(P<0.05或P<0.01)。③TTC染色、疾病及病理指标:术后24h各组(除假手术组)大鼠脑切片经TTC染色均有面积不等的白色梗死区域;假手术组大鼠无神经功能缺损,模型组大鼠术后2天和28天神经功能缺损明显,与模型组比较,益气活血方组术后28天神经功能缺损明显减轻(P<0.05);脑组织病理形态观察显示,假手术组脑组织形态结构正常,模型组脑组织形态结构发生病变,且随着病程的发展而加重;益气活血方组术后2天和28天脑组织形态结构病变明显减轻。第二部分:与假手术组比较,模型组术后2天和28天脑皮层ATP含量及EC值均明显减少(P<0.01),AMP含量和AMP/ATP比值均明显增加(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,益气活血方组术后2天和28天脑皮层ATP含量及EC值均明显增加(P<0.05或P<0.01),AMP/ATP比值均明显减少(P<0.05),术后2天脑皮层AMP含量明显减少(P<0.05)。第三部分:与假手术组比较,模型组术后2天和28天血清乳酸含量及乳酸/丙酮酸比值均明显增加(P<0.05或P<0.01),丙酮酸含量明显减少(P<0.05或P<0.01),葡萄糖、游离脂肪酸含量及乳酸脱氢酶活性均无明显变化;与模型组比较,益气活血方组术后2天和28天血清葡萄糖及丙酮酸含量均明显增加(P<0.01),游离脂肪酸含量及乳酸/丙酮酸比值均明显减少(P<0.01),术后2天血清乳酸含量及乳酸脱氢酶活性均明显降低(P<0.05)。与假手术组比较,模型组术后2天和28天脑皮层乳酸、游离脂肪酸含量及乳酸/丙酮酸比值均明显增加(P<0.05或P<0.01),丙酮酸含量明显减少(P<0.05),术后2天脑皮层乳酸脱氢酶活性明显增加(P<0.05),术后28天脑皮层葡萄糖含量明显减少(P<0.05);与模型组比较,益气活血方组术后2天和28天脑皮层丙酮酸含量明显增加(P<0.01),游离脂肪酸含量及乳酸/丙酮酸比值均明显减少(P<0.05或P<0.01),术后28天脑皮层葡萄糖含量明显增加(P<0.05),乳酸含量明显减少(P<0.01),乳酸脱氢酶活性无明显变化。第四部分:Western Blot结果显示,模型组术后2天和28天脑皮层p-AMPK、p-ACC表达均明显高于假手术组(P<0.05或P<0.01),CPT-1表达明显低于假手术组(P<0.05或P<0.01),益气活血方组术后2天和28天脑皮层p-AMPK、p-ACC及CPT-1表达均高于模型组(P<0.05);免疫组化结果显示,模型组术后2天和28天脑组织p-ACC表达明显高于假手术组(P<0.05),CPT-1表达明显低于假手术组(P<0.05),益气活血方组术后2天和28天脑组织p-ACC及CPT-1表达均高于模型组(P<0.05)。结论:多发性脑梗死气虚血瘀证大鼠模型急性期和恢复期ATP生成减少,AMP/ATP比值增加,能荷值下降,能量代谢明显障碍;该病证结合模型能量代谢紊乱与三羧酸循环及脂肪酸β-氧化减弱相关;AMPK及其介导的ACC、CPT-1信号通路对该病证结合模型的证候及能量代谢产生影响;益气活血方通过影响AMPK及其介导的ACC、CPT-1信号通路,调节能量代谢,减轻该病证结合模型的病变程度。本研究结果初步揭示了能量代谢障碍、AMPK及其介导的下游信号通路可能是脑梗死气虚血瘀证大鼠模型形成与发展、气虚血瘀证及益气活血治法的生物学基础,为临床应用和进一步的实验研究提供了有价值的靶点和思路。