研究目的：观察中药复方乳岩宁及益气消积方联合他莫昔芬（TAM）对MCF-7荷瘤裸鼠一般状态及体内雌激素的影响，了解中药复方乳岩宁及益气消积方联合TAM是否有协同增效的作用；观察中药复方联合TAM对MCF-7乳腺癌细胞凋亡的影响及其诱导细胞凋亡的作用机制；观察中药复方联合TAM对MCF-7乳腺癌细胞周期分布、细胞周期相关调控蛋白CyclinD1及凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，了解中药复方联合TAM抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖的作用机理；通过观察中药复方联合TAM对MCF-7乳腺癌细胞增殖的MAPK信号转导通路的ERK1/2、ERα蛋白及对HER-2基因mRNA表达的影响，了解中药复方联合TAM抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖的信号传导途径。研究方法：1.MCF-7荷瘤裸鼠移植模型的建立:将进入对数生长期的MCF-7细胞用胰酶/EDTA消化后，PBS液清洗2次，加入细胞培养液，直接吹打均匀，0.4%台盼蓝染色，记录活细胞数（＞95%），细胞计数板上作细胞计数，调节活细胞浓度为1×107/ml，裸鼠右侧胸壁碘伏消毒，于无菌条件下施行BALB/c-nu/nu裸鼠右侧胸壁第二乳垫下接种细胞液0.2ml/只，裸鼠继续饲养于层流罩中。接种后10-15天，在接种部位乳垫处出现肿瘤结节，质地较硬，而且逐渐增大，越长越快，认为原代肿瘤造模成功。当原代肿瘤长至0.8cm3大小时，无菌手术取下肿瘤，放入DMEM培养液中，剪切成1mm3左右的小块，利用骨髓穿刺针分别移植至余40只裸小鼠乳垫下，不需要缝合伤口，移植后第4天后即可见肿瘤生长，成瘤率100%。经HE染色病理诊断为浸润性导管癌。2.实验分组：将40只造模成功裸鼠随机分为模型组、他莫昔芬(TAM)组、乳结合组（乳岩宁+TAM）和益结合组（益气消积方+TAM）。模型组给蒸馏水0.2ml.只-1，TAM组为3.6mg.kg-1体重(相当于临床人用量的9倍)，中药乳岩宁为33.3g.kg-1体重(相当于临床人用量的12倍)，中药益气消积方为35.3g.kg-1体重(相当于临床人用量的12倍)，中药+TAM组为中药乳岩宁或者益气消积方+TAM3.6mg·kg-1体重，每日灌胃1次，连续给药21d。3.检测指标：(1)隔日测量裸鼠体重，绘画体重变化曲线，观察饮食、活动、色泽、精神状态及死亡情况；分别于用药前、实验第10天、21天用小鼠自主活动测试仪测小鼠5分钟内自主活动次数；处死裸鼠前摘眼球取血约0.5ml-1ml，将血置于试管中，室温静置1-2小时后，2500转/分，离心10min，分离上清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠血清中雌二醇（E2）和孕酮（PROG简称P）水平；处死裸鼠摘取子宫称重并计算子宫脏器系数。子宫脏器指数=子宫重量(mg)/体重(g)。(2)用药21天后脱颈处死裸鼠，完整剥离肿瘤称重，计算抑瘤率，抑瘤率按照公式=(模型组瘤重一实验组瘤重)/模型组瘤重×100%计算；肿瘤组织经4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡与包埋，用石蜡切片机切片，组织切片厚度为5μm，苏木素、伊红染色后光镜观察病理形态学变化；采用TUNNEL法检测肿瘤细胞凋亡率，肿瘤组织，常规石蜡包埋、切片，其余方法步骤按试剂盒说明书进行。细胞核内出现绿色荧光者为阳性细胞，荧光显微镜下观察，每张染色后的切片随机选择5个400×典型的高倍视野，每个视野分别观察100个细胞，共500个细胞，计算出每100个细胞内的阳性细胞平均数作为凋亡指数（Apoptosis Index，AI）。AI=阳性细胞数/计数的细胞个数×100%；进一步以超薄切片术快速冷冻肿瘤组织，采用戊二醛和四氧化锇的双固定法将其固定，脱水、浸透、包埋、切片、透射电镜(TEM)进行超微结构水平上的观测。(3)用药21天后完整剥离出瘤体，称重后置于冰盒上，并将标本切开取材，置于EP管中，-80℃冰箱中冻存用于蛋白测定。乳腺癌组织块剪碎后用0.25%胰酶消化30min－1h，过200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液，75％冷乙醇（－20℃预冷）固定细胞12h以上，加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h后上流式细胞仪检测细胞周期；采用免疫组织化学法对凋亡调控基因Bcl-2、Bax的表达进行定性分析；应用Western blot蛋白免疫印迹法检测凋亡调控基因Bcl-2、Bax及细胞周期相关调控蛋白CyclinD1的表达，并对结果进行统计分析。(4)RT-PCR的取材是将组织置于1mlTrizol中，标本作好标记后，立即置于-80℃冰箱中冻存备用。Western blot法检测乳腺癌组织中ERK1/2、ERɑ蛋白的表达，RT-PCR法检测乳腺癌组织中HER-2基因mRNA的表达。研究结果：(1)体重：TAM组裸鼠体重下降最明显（3.18±0.061），乳结合组次之（2.5±0.042），益结合组（1.3±0.019），组间比较有统计学差异（p﹤0.01），各用药组裸鼠的体重均低于模型组（p﹤0.05）；自主活动次数：实验第10、21天结合组裸鼠活动次数，两个结合组明显优于TAM组（p<0.01）；子宫脏器指数：乳结合组最高，TAM次之，益结合组次之，均明显高于模型组(p <0.01)，而三个用药组之间对比无明显差异（p>0.05）；雌激素水平结果：TAM可以降低血清中E2和P的水平,与模型组相比差异显著(p<0.01)，乳结合组的E2水平明显低于TAM组(p<0.01)，益结合组的E2水平与TAM组对比无明显差异（p>0.05），而两个结合组对P水平的影响显著，明显低于模型组(p<0.01)。(2)瘤重：TAM组、乳结合组、益结合组的的肿瘤重量均低于模型组，与模型组比较有非常显著差异（p﹤0.01），乳结合组明显低于TAM组（p﹤0.01），但是TAM组与益结合组、乳结合组与益结合组对比无明显差异（p＞0.05），TAM组、乳结合组、益结合组的抑瘤率分别为32.9%、44.9%、37.1%；TUNEL结果： TAM组、乳结合组、益结合组与模型组相比，其细胞凋亡指数(AI)比较有统计学差异(p <0.01)；其中乳结合用药组具有最高的AI，益结合组次之，二者比较无统计学差异（p＞0.05），但是与单独用药TAM组相比差异均有统计学意义(p<0.01)；HE染色提示病理为浸润性导管癌，模型组可见境界清楚的癌巢，细胞密集排列，核大深染，病理性核分裂象多见，异型性明显，而各用药组肿瘤细胞略增大，瘤组织结构破坏，部分细胞固缩成为孤立的细胞，可见大量坏死、凋亡细胞。坏死的肿瘤细胞周围有大量的淋巴细胞和白细胞浸润，显示出肿瘤细胞的生长受到抑制；透射电镜下观察发现模型组乳腺癌细胞体积大，核大，核浆比例失调，胞质内细胞器丰富，各用药组肿瘤细胞以凋亡变化为主，并可见晚期典型凋亡表现--大量凋亡小体，其中TAM组电镜下可见少量坏死细胞。(3)流式细胞仪检测细胞周期结果显示：各用药组G0/G1期细胞的比例增多，S期比例明显减少，与模型组比较差异显著（P<0.01），但是乳结合组与益结合组分别对比G0/G1期、S期的细胞比例均无统计学差异（P﹥0.05）；免疫组化法对凋亡调控基因Bcl-2、Bax的检测：Bcl-2及Bax蛋白表达阳性主要定位于细胞浆，有的在胞膜，Bcl-2染色显示，模型组细胞浆浓染呈黄色、棕黄色甚至深棕褐色，而各用药组细胞浆着色明显减弱，呈淡黄色，有的细胞甚至呈阴性。Bax染色显示，模型组细胞浆染色呈淡黄色，而各用药组细胞浆着色则明显增强，尤以核周、胞膜明显，黄染加重。Western blot半定量提示：模型组中Bcl-2蛋白存在高表达，Bax低表达，Bcl-2/Bax的比值显著升高，与三个治疗组相比有显著性差异（p﹤0.01）；TAM组、乳结合组和益结合组，都可不同程度的降低Bcl-2蛋白的表达，并使Bax蛋白表达增加，Bcl-2/Bax的比值降低，其中乳结合组的作用更为显著，益结合组次之，TAM组再次之，两个结合组与TAM组相比较有显著性差异（p﹤0.01），而两个结合组相比较无统计学差异（p﹥0.05）。说明模型组中存在乳腺癌细胞生长失去控制，凋亡过程受阻现象。各用药组均可下调Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，使Bcl-2/Bax的比值降低，从而诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡，而且以二者联合应用诱导凋亡的作用最为显著。Western blot法检测Bcl-2、Bax及细胞周期相关调控蛋白CyclinD1的表达结果：Western blot法检测凋亡调控基因Bcl-2、Bax的结果与免疫组化检测结果基本一致，TAM组、乳结合组和益结合组，都可不同程度的降低Bcl-2蛋白的表达，并使Bax蛋白表达增加，降低Bcl-2/Bax的比值，其中乳结合组的作用最为显著，益结合组次之，两个结合组与TAM组相比较有显著性差异（p﹤0.01），而两个结合组相比较无统计学差异（p﹥0.05）。模型组中CyclinD1蛋白存在高表达，各用药组中CyclinD1蛋白表达水平明显下降，明显低于模型组（p﹤0.01）；其中以乳结合组的作用最为显著，益结合组次之，两个结合组与TAM组相比较有显著性差异（p﹤0.01），说明各用药组乳腺癌细胞细胞周期阻滞于G0/G1期与下调CyclinD1蛋白表达有关。(4)Western blot检测ERK1/2、ERɑ蛋白表达的结果： TAM组、乳结合组和益结合组，都可不同程度的降低ERK1/2、ERɑ蛋白的表达，明显低于模型组（p﹤0.01）；其中乳结合组的作用最为显著，益结合组次之，两个结合组与TAM组相比较有显著性差异（p﹤0.01），而两个结合组相比较无统计学差异（p﹥0.05）。RT-PCR法检测乳腺癌组织中HER-2基因mRNA表达的结果：TAM组、乳结合组和益结合组，都可不同程度的降低HER-2基因mRNA的表达，明显低于模型组（p﹤0.01）；其中乳结合组的作用最为显著，益结合组次之，TAM组再次之，两个结合组与TAM组相比较有显著性差异（p﹤0.01），而两个结合组相比较无统计学差异（p﹥0.05）。结论:1.中药复方能改善荷瘤裸鼠一般状态，减轻TAM带来的裸鼠体重下降，改善裸鼠活动能力。2.中药复方与TAM合用可明显降低体内雌激素E2、P水平。3.中药复方联合TAM具有抑制乳腺癌生长的作用，可能与阻滞细胞周期进程及诱导细胞凋亡有关。4.中药复方联合TAM可能是通过下调通过癌组织中HER-2基因mRNA的表达来抑制MAPK信号通路的活性，下调ERK1/2、ERɑ蛋白的表达来抑制乳腺癌细胞增殖的。5.中药复方与TAM合用有协同增效的作用，但是中药乳岩宁方与益气消积方对比疗效无明显差异。