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石斛为主要兰科植物之一,主要分布于亚洲热带和亚热带,我国大部分分布于西南、华南、台湾等地。由于石斛种子极其微小,无胚乳,其自身营养不足以支持种子萌发,自然条件下往往依赖与之共生的内生真菌建立共生关系后才能够发芽,石斛-菌根真菌的共生关系对于石斛种群繁衍极其重要。目前虽然已经从兰科植物中分离获得多种共生真菌,但石斛-真菌共生分子机制研究却相对滞后。本研究利用植物组织培养技术构建菌根真菌与石斛种子的共培养体系。利用RNA-seq技术对真菌与石斛共生和非共生状态下的材料进行转录组测序,分别研究石斛在与真菌共生和非共生条件下石斛与真菌的基因表达模式和表达水平差异,挖掘与共生相关的关键基因,运用生物信息学方法对相关基因进行全基因组预测分析,解析―石斛—菌根真菌‖共生分子调控机制。主要研究结果如下:1.从6个春兰和蕙兰样品中共分离到40种内生细菌,分布在15个不同的属内。还分离得到3株潜在新菌。内生细菌鉴定为后续兰科植物与根际微生物共生机制研究奠定了基础。2.选用分离自湖北随州野生春兰(Cymbidium goeringii)根部的美孢胶膜菌菌株Tcg(Tulasnella calospora),利用8.0 g·L-1的燕麦培养基建立石斛种子与美孢胶膜菌共生萌发体系,通过台盼蓝染色在共生萌发的种子内部检测到共生真菌菌丝。3.采用RNA-seq技术对共生萌发种子(DoTcg)、非共生萌发种子(Do)、非共生美孢胶膜菌(Tcg)共9份样品(每组设置三个生物学重复)进行转录组测序,共获得96 G高质量的转录组数据。样品间生物学重复系数(R2)介于0.97-0.99之间,生物学重复性好。对石斛转录组数据进行有参考基因组分析,45%-60%转录组数据mapping到石斛基因组上,其中比对到exon区域的reads比例在70%左右,比对到intron区域的reads数量最少,比对到基因间隔区的reads数量在25%左右。基于已发表的石斛基因注释文件发现新的功能基因,并对已知基因进行结构优化,最终对16 872个基因进行结构优化,可以对石斛基因组数据库进行补充。4.美孢胶膜菌转录组数据采取de novo拼接组装,共获得transcripts序列58 967条,其中长度大于1000 bp的unigenes序列为15 257条,占25.87%,N50 unigene序列长度为1 488 bp。在6个美孢胶膜菌转录本数据库中检测到的SNP位点数约6.5-7.0万,其中非编码序列的SNP位点约为1.5-1.7万,编码序列的SNP位点约为5万,其中大部分SNP位点为同义替换。5.对共生和非共生样品中差异表达基因分析发现,在石斛与菌根菌共生萌发的种子中预测获得5类激素信号转导途径相关差异表达基因:9个参与ABA信号转导基因、4个参与GA信号转导途径基因、15个参与IAA信号转导途径基因、1个参与油菜素甾醇信号通路基因、10个参与细胞分裂素信号途径基因。在共生菌根真菌美孢胶膜菌的转录组测序数据中检测获得6个差异表达的甘氨酸/丝氨酸羟甲基转移酶基因差异表达显著,4个赤霉素受体蛋白基因GID1差异表达显著,7个AUX/IAA家族蛋白基因差异表达显著,3个生长素响应和受体蛋白上调差异显著。在共生萌发的种子与共生的美孢胶膜菌中均预测获得一些与矿质元素转运与吸收相关的基因。在石斛6个转录组数据库中检测到44类共333个转录因子序列在共生与非共生萌发的种子中差异表达。这些在共生和非共生样品中差异表达的基因可能参与石斛与菌根菌共生体系的建立。6.利用石斛已经发表的genome数据,采用生物信息学方法对石斛DoPC、DoWRKY家族基因进行全基因组范围内预测分析,对其蛋白结构特点、基因结构特点、基因进化情况、及其在共生和非共生萌发种子中的表达情况进行了分析。结构显示:石斛全基因组中共预测到包含PCLD结构域的38个DoPCs,可分属4个亚家族,两个Cys残基在DoPCs家族中高度保守;19条DoPCs蛋白序列含有4个完整的保守铜结合配体(His、Cys、His、Gln/Met),有32条DoPCs骨架中含有N-端信号肽,22条DoPCs含有糖基磷脂酰肌醇锚定位点,有27条DoPCs含N-糖基化位点;16个DoPCs基因在与美孢胶膜菌共生萌发的种子中检测到表达,其中DoUCL2,4和DoENODL14基因表达量最高,7个基因在共生萌发的种子中明显上调表达,只有DoENODL6基因明显下调表达。本研究共获得52条DoWRKY氨基酸序列,其中,7条序列含有2个保守的WRKY结构域,45条序列含有1个保守的WRKY结构域;选取DoWRKY基因上游1.5-kb区域序列,通过在线PLANTCARE数据库进行启动子区顺式作用元件的预测,结果对48条基因启动子区参与盐/干旱诱导的MYB-binding位点,低温、真菌、MeJA和热击响应元件等12种顺式作用元件的种类及数量进行了统计。所有在启动子区预测到顺式作用元件的48个genes中,至少包含2种胁迫或激素响应相关的顺式作用元件,说明它们可能参与多种胁迫或激素应答。在共生萌发种子中共检测到7个DoWRKY家族基因差异表达,而且这些基因均在共生萌发的种子中上调表达。其中,DoWRKY08基因表达差异最显著;DoWRKY20和31两个基因在共生萌发的种子呈现高表达现象。在全基因组范围内分析石斛DoPC、DoWRKY家族蛋白结构特点,可以为探究兰科植物与微生物共生的相互作用,进一步解析兰科菌根形成的分子机制提供数据基础。