背景脑胶质瘤,广义上是指所有神经上皮细胞来源的肿瘤,而组织病理学上则常指来源于各类胶质细胞的肿瘤,是神经系统最常见的原发性肿瘤,预后很差,而且多见于青壮年患者,给整个社会和家庭造成了沉重的负担。目前脑胶质瘤治疗需要多学科合作的综合治疗,包括显微手术切除为主,术后辅助放化疗。但即便采用了手术、放疗、化疗等综合治疗手段,由于大多数胶质瘤细胞对放疗和化疗不敏感,其复发率和死亡率仍然居高不下。因此,开展其他行之有效的替代或者辅助治疗手段对改善胶质瘤患者的预后和生存质量具有重要意义。氩氦靶向冷冻手术治疗技术(简称氩氦刀)是近些年源自美国引进的一种超低温冷冻技术。作为一种局部冷冻消融技术,由于其能密切监控冷冻温度、冷冻范围,以及对周围组织可以实时测温的优点,能够更好的保留更多正常脑组织,而且对脑功能区胶质瘤或者靠近大的、重要血管解剖位置的胶质瘤、复发或残留的胶质瘤均可以治疗。氩氦刀能引起细胞膜破裂,肿瘤细胞内的抗原大量释放,从而激活机体的免疫系统。目前随着肿瘤免疫学的巨大进步,肿瘤免疫治疗在许多实体肿瘤的治疗中取得了令人鼓舞的成果,特别是恶性黑色素瘤。氩氦冷冻消融不仅可摧毁局部肿瘤组织,还可引起肿瘤局部和全身的免疫反应,消灭残留或复发的肿瘤。有研究报道,氩氦刀治疗除了直接物理破坏肿瘤细胞,还能促进树突状细胞的成熟,从而激活机体的细胞免疫功能,实现了局部微创治疗和免疫治疗的完美结合。尽管氩氦冷冻消融治疗可有效诱导机体的免疫反应,但由于肿瘤患者常处于抗肿瘤免疫反应受抑制状态,因此有必要通过免疫增强剂来扩大机体的抗肿瘤免疫反应,合理选择免疫调节剂决定着冷冻原位肿瘤疫苗能否在临床应用中得到推广。有研究表明GM-CSF可增加肿瘤局部DCs数量、淋巴器官中DCs数量及活化比例,诱导脾脏细胞产生特异性抗肿瘤免疫反应,促进机体免疫状态向Th1反应转化。目前GM-CSF作为免疫增强剂的GVAX肿瘤疫苗,在黑色素瘤、前列腺癌、NSCLC和肾癌等疾病中进行了大量临床试验,结果表明GM-CSF能作为一个有效的免疫增强剂刺激机体产生抗肿瘤免疫反应。同时,GM-CSF生物性能稳定,临床应用安全有效,是一个颇具应用潜能的免疫调节剂。在脑胶质瘤治疗中,有部分手术后残留或者复发而不愿行手术治疗的患者,或者位于重要的大血管附近胶质瘤,氩氦冷冻消融病灶可由于血流对血管的保护作用而避免血管损伤。对于此类患者,氩氦冷冻治疗为其提供了一个有效的选择。但该技术方法在脑胶质瘤中的应用还不够成熟,缺乏必要的基础研究及动物实验。另外GM-CSF是否可以有效增强胶质瘤小鼠的氩氦冷冻免疫反应,目前尚没有实验报道。本课题通过在C57BL/6小鼠背部成功建立GL261胶质瘤模型,在局部行氩氦冷冻治疗,同时联合免疫增强剂GM-CSF,分析探讨两者联合治疗胶质瘤的可行性和有效性,以及时间-效应关系；通过动态观察从小鼠脾脏树突状细胞免疫功能的时间动态变化,并与单纯氩氦冷冻治疗、单纯GM-CSF注射治疗两种单一治疗方式相对比,希望探明氩氦冷冻局部治疗与全身免疫反应之间内在联系,以及脾脏细胞免疫功能的变化规律,进一步探究使用患者自身肿瘤抗原,在体内增加DCs对抗原的摄取,从而形成自身DCs疫苗,在自体内诱导出特异性抗肿瘤免疫反应,希望实现DCs疫苗的个体化,为临床应用提供一个初步理论参考。第一章C57BL/6小鼠GL261小鼠脑胶质瘤模型建立及氩氦冷冻联合GM-CSF治疗的生存期观察研究目的观察氩氦冷冻联合GM-CSF治疗荷胶质瘤小鼠的疗效。研究内容(1)荷胶质瘤小鼠模型的建立；(2)观察不同治疗方案对胶质瘤小鼠的治疗效果,包括一般情况及肿瘤大小等；(3)荷胶质瘤小鼠生存期。研究方法：1、荷胶质瘤小鼠模型建立及分组：GL261胶质瘤细胞株复苏、传代后,制备单细胞悬液,种植于C57BL/6小鼠背部靠近臀部处皮下,建立小鼠胶质瘤模型；肿瘤组织行HE染色进行肿瘤组织的形态学观察,确定荷胶质瘤小鼠模型的成功建立；造模成功的小鼠随机分为模型对照组、单纯GM-CSF注射组、单纯氩氦冷冻组和氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组。2、观察各组小鼠肿瘤大小及荷瘤小鼠的生存期：接种后每天密切观察小鼠活动情况：小鼠进食是否正常,毛色是否光滑整齐,背部接种部位是否膨隆；接种后每3天测量一次小鼠的体重,隔日观察小鼠皮下胶质瘤的成瘤及生长情况,根据测量的肿瘤最大长径A和最小宽径B,计算肿瘤的体积(其体积为A×B2/2)；记录小鼠生存时间,以70天为观察终点,绘制生长曲线图。3、统计学分析：所有实验数据均采用21.0统计软件进行处理,计量资料数据以x±s表示。各个治疗组小鼠的生存时间记录为：平均生存时间(天)±标准差,采用Kaplan-Meier生存分析法描绘各个治疗组小鼠生存分析曲线, 组间比较采用log-rank检验,多重比较采用Bonferroni校正,都与Cryo+GM-CSF组比较, 共三次, 校正后检验水准为0.05/3=0.0167；各治疗组小鼠肿瘤体积的变化采用重复测量的方差分析,各时间点之间的多重比较采用LSD方法。以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1、GL261细胞呈贴壁生长,状态良好；小鼠接种胶质瘤细胞后,进食未见明显异常,活动稍受限,毛发光泽度较前稍差,接种部位随时间延长逐渐膨隆,表面无破溃、出血；种植肿瘤细胞后第14-16天,肉眼可见小鼠背部接种部位明显膨隆,肿块大小约为2.5-3.0cm3,表面无破溃；肿瘤组织光学显微镜下观察,肿瘤细胞呈圆形、梭形或多角形,排列紊乱,细胞核呈圆形或不规则形,染色质深染,病理性核分裂象活跃,局部可见坏死区域；2、动态观察不同治疗组荷瘤小鼠肿瘤大小的变化：①各种不同治疗方案下动态观察肿瘤大小变化：模型对照组：对照组小鼠背部肿瘤随时间逐渐增大,差异有统计学意义(F=20.287,P<0.001);单纯GM-CSF注射组：与治疗前相比较,治疗后小鼠背部肿瘤亦随时间逐渐增大,差异有统计学意义(F=6.179,P=0.007)；单纯氩氦冷冻组：与治疗前相比较,治疗后7天肿瘤稍有增大,但随着时间继续延长,肿瘤逐渐缩小,与治疗前比较,各组之间差异有统计学意义(F=14.555,P<0.001);氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组：与治疗前相比较,治疗后7天肿瘤稍有增大,但随着时间继续延长,肿瘤逐渐缩小,与治疗前比较,各组之间差异有统计学意义(F=27.071,P<0.001)。②同一时间点下不同治疗方案对肿瘤大小影响：治疗前,不同治疗组之间肿瘤大小差异无统计学意义(F=2.453,P=0.075)；治疗后7天,各治疗组小鼠肿瘤均较模型对照组小,不同治疗组之间肿瘤大小差异无统计学意义(F=2.527,P=0.069)；治疗后14天,各治疗组小鼠肿瘤均较模型对照组小,联合治疗组肿瘤最小,其次是单纯氩氦冷冻组,再次为单纯GM-CSF注射组,各组间比较差异有统计学意义(F=114.948,P<0.001)；治疗后21天,各治疗组小鼠肿瘤均较模型对照组小,联合治疗组肿瘤最小,其次是单纯氩氦冷冻组,再次为单纯GM-CSF注射组,各组间比较差异有统计学意义(F=165.392,P<0.001)。各组间效应之间差异有统计学意义(F=19.612,P<0.001),各个时间点肿瘤体积变化差异有统计学意义(F=3.934,P=0.014),两者之间具有交互效应(F=20.354,P<0.001)。总结：单纯GM-CSF注射治疗可以延缓小鼠胶质瘤生长,但不能杀灭肿瘤,抑制肿瘤生长；单纯氩氦冷冻治疗可以在一定程度上减小了肿瘤的体积；而二者联合治疗后可以呈现协同效应,明显抑制了肿瘤的生长3、各种不同治疗方案对荷瘤小鼠生存时间的影响：各组小鼠平均生存时间(天)分别为：模型对照组38.10±1.77,单纯GM-CSF注射组43.40±2.14,单纯氩氦冷冻组63.80±2.77,氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组69.80±0.19,氩氦冷冻联合GM-CSF组小鼠平均生存时间最长,其次是单纯氩氦冷冻组,单纯GM-CSF注射组和模型对照组小鼠均未存活至观察终点,各组生存时间相比,差异有统计学意义(χ2=47.300,P<0.001)。结论：1、荷胶质瘤小鼠模型成功建立：该方法可以成功建立C57BL/6小鼠GL261胶质瘤模型,形成的肿瘤组织光镜下观察符合恶性胶质瘤的生物学行为。建立的胶质瘤模型生长期符合预期,种植肿瘤细胞后第14-16天,肉眼可见小鼠背部接种部位明显膨隆,肿块大小约为2.5-3.0cm3,表面无破溃。适合行各种治疗干预。2、不同治疗方案对胶质瘤小鼠的治疗效果：单纯GM-CSF注射治疗可以延缓小鼠胶质瘤生长,但不能杀灭肿瘤,抑制肿瘤生长；单纯氩氦冷冻治疗可以在一定程度上减小了肿瘤的体积；而二者联合治疗后可以呈现协同效应,明显抑制了肿瘤的生长。3、氩氦冷冻联合GM-CSF治疗可以延长荷胶质瘤小鼠的生存期。第二章氩氦冷冻联合GM-CSF治疗对荷脑胶质瘤小鼠脾脏树突状细胞免疫功能的影响研究目的探讨氩氦冷冻联合GM-CSF治疗荷胶质瘤小鼠是否可通过引起脾脏DCs活化来引起特异性抗肿瘤免疫,为进一步探索胶质瘤免疫治疗提供一个理论依据。研究内容(1)荷胶质瘤小鼠模型的建立；(2)动态观察不同治疗方案治疗前后小鼠脾脏DCs数量变化及活化情况,明确氩氦冷冻联合GM-CSF是否可以有效活化DCs从而将肿瘤特异性抗原呈递给T细胞,激活机体抗肿瘤免疫以杀死胶质瘤细胞。研究方法1、荷胶质瘤小鼠模型建立及分组：将成功种植GL261细胞并成瘤的荷瘤小鼠随机分为模型对照组、单纯GM-CSF注射组、单纯氩氦冷冻组和氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组,每组20只。各组动物分干预治疗前、治疗后7、14、21d共4个时间点,每个时间点在各组内随机抽取5只小鼠进行相关指标检测。2、免疫组织化学法检测各治疗组在治疗前和治疗后7天、14天、21天不同时间点DCs表面标记CDllc在脾脏的表达情况。3、流式细胞术检测各治疗组在治疗前和治疗后7天、14天、21天不同时间点的脾脏DCs的活化情况。4、酶联免疫吸附法(ELISA)检测各治疗组在治疗前和治疗后7天、14天、21天不同时间点脾脏细胞IFN-γ的分泌水平。5、LDH实验检测治疗前和治疗后7天、14天、21天不同时间点脾脏细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)的杀伤活性。6、统计学分析：所有实验数据均采用21.0统计软件进行处理,数据以x±s表示。不同组间不同时间点采用2×2析因实验设计的方差分析,多重比较采用LSD。以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、光镜下观察：CD11c主要表达于细胞膜表面,CD11c+细胞(DCs)主要分布于脾脏边缘区、脾索和淋巴滤泡处,体积较大,细胞核不规则。2、免疫组化法检测脾脏中CD11c+细胞数在各个治疗组和不同时间点的动态变化情况：①同一治疗组脾脏DCs数量随时间的变化：模型对照组：与治疗前相比较,各个时间点DCs数量无明显变化,各时间点比较差异无统计学意义(F=0.107,P=0.955)；单纯GM-CSF注射组：与治疗前相比较,治疗后7天及14天DCs数量显著高于治疗前,但随着时间延长,DCs数量逐渐下降,至治疗后21天,已降至治疗前水平,各时间点比较差异有统计学意义(F=44.358,P<0.001)；单纯氩氦冷冻组：与治疗前相比较,治疗后脾脏DCs数量显著高于治疗前,随着时间延长,DCs数量逐渐下降,至治疗后21天,仍较治疗前增多,各时间点比较差异有统计学意义(F=97.705,P<0.001)；氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组：与治疗前相比,治疗后脾脏DCs数量显著高于治疗前,随着时间延长,DCs数量虽逐渐下降,但至治疗后21天仍显著高于治疗前,各时间点比较差异有统计学意义(F=417.947,P<0.001)；各时间点脾脏DCs数量变化总体比较,差异有统计学意义(F=338.725,P<0.001)。②各个时间点不同治疗方案对脾脏DCs数量的影响：治疗前,各组脾脏DCs数量无统计学意义差异(F=0.525,P=0.667)；治疗后7天,各治疗组脾脏DCs数量均较对照组升高,尤以氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组最高,各组间比较,差异有统计学意义(F=352.023,P<0.001)；治疗后14天,各治疗组脾脏DCs数量均较对照组升高,尤以氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组最高,各组间比较,差异有统计学意义(F=371.914,P<0.001)；治疗后21天,脾脏DCs数量：氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组>单纯氩氦冷冻组及单纯GM-CSF注射组,各组之间比较,差异有统计学意义(F=45.281,P=0.000)；各组脾脏DCs数量变化总体比较,差异有统计学意义(F=464.437,P<0.001),各治疗组和各时间点之间有交互效应,(F=89.925,P<0.001)；总结：单纯GM-CSF注射治疗和单纯氩氦冷冻治疗均可增加脾脏组织内DCs数量,但氩氦冷冻联合GM-CSF治疗对脾脏DCs数量的增加更明显,从时间变化趋势上看,联合治疗组DCs数量增加更明显,持续时间更长。3、流式细胞术检测小鼠脾脏单位体积内DCs活化(CD11c+MHCⅡ+、 CD11c+CD86+)在各治疗组和不同时间点的动态变化情况：①各个治疗组小鼠脾脏DCs活化数量随时间变化情况：模型对照组：各时间点,流式检测CD11C+MHCⅡ+细胞数量差异无统计学意义(F=0.990,P=-0.422)；流式检测CD11c+CD86+细胞数量差异亦无统计学意义(F=1.602,P=0.228),证实模型对照组各个时间点脾脏活化DCs数量无明显差异；单纯GM-CSF注射组：与治疗前相比较,治疗后脾脏活化DCs数量减少；各时间点,流式检测CD11c+MHCⅡ+细胞数量差异差异有统计学意义(F=90.296,P<0.001);流式检测CD11c+CD86+细胞数量差异有统计学意义(F=33.357,P<0.001),证实单纯GM-CSF注射无法活化小鼠脾脏DCs；单纯氩氦冷冻组：与治疗前相比较,治疗后7天脾脏活化DCs数量明显增多,但随时间延长逐渐下降,至治疗后14天,回复到治疗前水平,而CD11c+CD86+细胞数量在治疗后21天甚至低于治疗前；各时间点,流式检测CD11C+MHCⅡ+细胞数量差异有统计学意义(F=12.911,P=0.003)；流式检测CD11c+CD86+细胞数量差异有统计学意义(F=18.759,P=0.003),证实氩氦冷冻治疗能够活化小鼠脾脏DCs,该作用在治疗后7天达到最高水平,随时间延长,氩氦冷冻对小鼠脾脏DCs细胞的活化作用逐渐减弱,到21天已接近正常或稍低于正常；氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组：与治疗前相比较,治疗后7天脾脏活化DCs数量明显增多,虽随时间延长逐渐下降,但直至治疗后21天,仍显著多于治疗前。各时间点,流式检测CD11c+MHCⅡ+细胞数量差异有统计学意义(F=85.842,P<0.001)；流式检测CD11c+CD86+细胞数量差异有统计学意义(F=123.759,P<0.001),证实联合治疗能够明显活化小鼠脾脏DCs,该作用在治疗后7天达到最高水平,随时间延长,氩氦冷冻对小鼠脾脏DCs细胞的活化作用逐渐减弱,但直至21天仍明显高于正常水平。②各个时间点脾脏DCs活化数量组间比较：治疗前,流式检测CD11C+MHCⅡ+细胞数量差异无统计学意义(F=0.037,P=0.990)；流式检测CD11c+CD86+细胞数量差异亦无统计学意义(F=1.661,P=0.249),证实治疗前各组之间小鼠脾脏DCs活化数量无差异。治疗后7天,脾脏活化DCs数量,氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组>单纯氩氦冷冻组>较模型对照组>单纯GM-CSF注射组,流式检测CD11c+MHCⅡ+细胞数量,各组间比较差异有统计学意义(F=210.835,P<0.001)；流式检测CD11C+CD86+细胞数量,各组间比较差异有统计学意义(F=335.721,P<0.001)；治疗后14天,脾脏活化DCs数量,氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组>单纯氩氦冷冻组>模型对照组>单纯GM-CSF注射组,流式检测CD11C+MHCⅡ+细胞数量,各组间比较差异有统计学意义(F=92.664,P<0.001)；流式检测CD11C+CD86+细胞数量,各组间比较差异有统计学意义(F=498.586,P<0.001)；治疗后21天,脾脏活化DCs数量,流式检测CD11c+MHCⅡ+细胞数量,,各组间比较差异有统计学意义(F=120.264,P<0.001)；流式检测CD11c+CD86+细胞数量,氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组>模型对照组>单纯氩氦冷冻组>单纯GM-CSF注射组,各组间比较差异有统计学意义(F=498.586,P<0.001);总结：单纯GM-CSF注射治疗并不能增加脾脏组织活化DCs数量,单纯氩氦冷冻组脾脏DC细胞活化数量虽有所增加,但随时间延长迅速下降,而氩氦冷冻联合GM-CSF治疗能显著增加脾脏组织内活化DCs数量,且持续时间长。说明GM-CSF的免疫增强作用在有氩氦冷冻释放的抗原基础上起协同作用,大大提高了DCs的活化效率。4、酶联免疫吸附法(ELISA)检测各治疗组在治疗前和治疗后7天、14天、21天不同时间点脾脏细胞IFN-γ的分泌水平：①各个治疗组脾脏IFN-γ分泌情况时间变化特征：模型对照组：各时间点脾脏组织IFN-γ分泌水平之间比较,差异无统计学意义(F=1.209,P=0.338)；单纯GM-CSF注射组：治疗前、后各时间点脾脏组织IFN-γ分泌水平之间比较,差异无统计学意义(F=0.188,P=0.903)；单纯氩氦冷冻组：与治疗前相比较,治疗后7天脾脏组织IFN-γ分泌量明显增多,随时间延长逐渐下降,至治疗后21天,仍多于治疗前,各个时间点IFN-γ分泌水平差异有统计学意义(F=35.778,P<0.001)；氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组：与治疗前相比较,治疗后7天脾脏组织IFN-γ分泌量明显增多,随时间延长逐渐下降,但至治疗后21天,仍显著多于治疗前,各个时间点IFN-γ分泌水平差异有统计学意义(F=78.085,P<0.001)。②各个时间点脾脏IFN-γ分泌情况组间比较：治疗前,各组脾脏组织IFN-γ分泌水平之间比较,各组之间差异比较无统计学意义(F=0.543,P=0.660)；治疗后7天,脾脏组织IFN-γ分泌量,各组之间总体比较,各组之间比较差异有统计学意义(F=122.592,P<0.001)；氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组>单纯氩氦冷冻组>模型对照组及单纯GM-CSF注射组,差异有统计学意义(P<0.05),模型对照组和单纯GM-CSF注射组相比差异无统计学意义(P=0.990)；治疗后14天,脾脏组织IFN-γ分泌量,各组之间总体比较,各组之间比较差异有统计学意义(F=46.221,P<0.001)；联合治疗组、单纯氩氦冷冻组和模型组之间差距有统计学意义(P<0.05),结合表2-4可知：氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组>单纯氩氦冷冻组>模型对照组及单纯GM-CSF注射组,而模型对照组和单纯GM-CSF注射组相比差异无统计学意义(P=0.999)；治疗后21天,各组间总体比较,差异有统计学意义(F=46.570,P<0.001),联合治疗组、单纯氩氦冷冻组和模型组之间差距有统计学意义(P<0.05),结合表2-4可知：氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组>单纯氩氦冷冻组>模型对照组及单纯GM-CSF注射组,而单纯GM-CSF注射组与模型对照组之间比较,差异无统计学差异(P>0.05)。总结：单纯GM-CSF治疗并不能增加脾脏组织IFN-γ分泌量,单纯氩氦冷冻虽能一定程度上增加脾脏IFN-γ分泌量,但升高效果并不十分显著,.而二者联合治疗能显著增加脾脏IFN-γ分泌量,且能在较长时间内维持高分泌量。5、LDH实验检测治疗前和治疗后7天、14天、21天不同时间点脾脏细胞CTLs杀伤活性：①各个治疗组脾脏CD8+CTLs的杀伤活性时间变化特征：模型对照组：各个时间点脾脏组织CD8+CTLs的杀伤活性差异比较无统计学意义(F=0.416,P=0.744)；单纯GM-CSF注射组：治疗前、后各个时间点,。脾脏组织CD8+CTLs的杀伤活性各个时间点之间比较,差异无统计学意义(F=1.644,P=0.219)；单纯氩氦冷冻组：治疗前、后各个时间点,脾脏组织CD8+CTLs的杀伤活性各个时间点之间总体比较,差异有统计学意义(F=110.762,P<0.001)；与治疗前相比较,治疗后7天脾脏组织CD8+CTLs的杀伤活性明显增强,随时间延长逐渐下降,至治疗后21天,仍高于治疗前(各组P<0.05)；氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组：治疗前、后各个时间点。脾脏组织CD8+ CTLs的杀伤活性各个时间点之间总体比较,差异有统计学意义(F=208.568,P<0.001)；与治疗前相比较,治疗后7天脾脏组织CD8+CTLs的杀伤活性明显增强,虽然随时间延长逐渐下降,但至治疗后21天时仍显著高于治疗前(各组P<0.05)。②各个时间点脾脏CD8+CTLs的杀伤活性组间比较：治疗前,各组脾脏组织CD8+CTLs的杀伤活性之间比较,差异无统计学意义(F=1.161,P=0.355)；治疗后7天,各组之间总体比较,各组之间比较差异有统计学意义(F=339.756,P<0.001)；脾脏组织CD8+CTLs的杀伤活性,多重比较采用LSD法,氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组>单纯氩氦冷冻组>模型对照组>单纯GM-CSF注射组,联合治疗组、单纯冷冻组和模型组相比差异有统计学意义(P<0.001),而单纯GM-CSF注射组与模型对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后14天及21天,氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组和单纯氩氦冷冻组脾脏组织CD8+CTLs的杀伤活性虽有所下降,但仍较模型对照组增强(P<0.05),且联合治疗组明显高于单纯冷冻组(P<0.05),而单纯GM-CSF注射组与模型对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。总结：单纯GM-CSF注射治疗并不能增加脾脏组织CD8+CTLs的杀伤活性,单纯氩氦冷冻治疗能一定程度上增强脾脏CD8+CTLs的杀伤活性,而氩氦冷冻联合GM-CSF治疗后脾脏CD8+CTLs的杀伤活性明显增加,且持续时间较长。结论采用免疫组化技术、流式细胞检测、ELISA实验和LDH实验等多种方法检测小鼠脾脏DCs的免疫功能变化,结果表明氩氦冷冻联合GM-CSF注射治疗能够增加DCs数量,增强脾脏DCs的活化,在体内促进DCs免疫功能活化,进而递呈胶质瘤抗原至T淋巴细胞,从而激活初始型T细胞,诱导出Thl型免疫应答,以及产生抗肿瘤细胞特异性CTL杀伤作用,其中GM-CSF对氩氦冷冻起到了协同和促进作用。本研究利用氩氦冷冻释放的肿瘤抗原,联合免疫增强剂GM-CSF注射,诱导出机体抗胶质瘤特异性的免疫反应,将胶质瘤的局部冷冻治疗与全身的抗肿瘤免疫反应结合了起来,为氩氦冷冻治疗的临床应用提供了一个理论基础。