【摘 要】
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血管表皮生长因子受体-2（VEGFR-2）是一类重要的酪氨酸跨膜蛋白,与肿瘤血管新生、淋巴结转移和肿瘤干细胞侵袭等过程密切相关,是抗肿瘤药物研究的重要靶点之一。Sorafenib是最早上市的一款VEGFR-2抑制剂,由于临床用药中出现耐药性和口服生物利用度低等问题限制了疗效。PROTAC靶向蛋白降解技术是研究最早,降解机制和E3泛素连接酶配体研究最为广泛的一种生物技术,而VEGFR-2-PROTA
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血管表皮生长因子受体-2（VEGFR-2）是一类重要的酪氨酸跨膜蛋白,与肿瘤血管新生、淋巴结转移和肿瘤干细胞侵袭等过程密切相关,是抗肿瘤药物研究的重要靶点之一。Sorafenib是最早上市的一款VEGFR-2抑制剂,由于临床用药中出现耐药性和口服生物利用度低等问题限制了疗效。PROTAC靶向蛋白降解技术是研究最早,降解机制和E3泛素连接酶配体研究最为广泛的一种生物技术,而VEGFR-2-PROTAC降解剂研究较少。本论文以VEGFR-2为靶点,进行了1H-吲唑类VEGFR-2抑制剂和VEGFR-2-PROTAC降解剂的设计、合成及其体外抗肿瘤活性研究,并对活性化合物分别进行了类药性评价和作用机制初步研究。第一部分以VEGFR-2抑制剂Sorafenib结构为基础,基于三维构象匹配的骨架跃迁设计策略,设计了一类6-（1H-吡唑-4-基）-1H-吲唑-3-胺类化合物,并对其所在的溶剂暴露区、连接区和疏水性口袋三部分进行了结构修饰和优化。通过以2-氟-4-氰基-溴苯为原料,经过吲唑构环、Buchwald-Hartwig和Suzuki偶联等化学合成反应,合成了26个新型1H-吲唑类化合物。生物活性评价结果表明,目标化合物整体具有较好的体外酶抑制和细胞毒活性,其中化合物W13表现出良好的体外VEGFR-2酶抑制活性(IC50:1.6 nM),中等的HUVEC细胞抗增殖活性(IC50:7.15±2.26μM),尤其对人胃癌HGC-27细胞的抑制活性(IC50:0.36±0.11μM)是人正常GES-1细胞的500倍以上(IC50:187.46±10.13μM)。机制研究表明,W13可以浓度依赖性地调节HGC-27细胞中MMP-9和E-cadherin蛋白表达,抑制细胞迁移和侵袭;并引起细胞内ROS表达增加和凋亡蛋白Bax与Bcl-x L表达水平的改变,诱导细胞凋亡;还通过减少VEGFR-2磷酸化引起下游PI3K-Akt-m TOR通路传导阻断,抑制细胞存活;此外,在HUVEC细胞小管形成实验中也表现出良好的抗血管新生活性。类药性研究表明,化合物W13对人和鼠源肝微粒体具有适宜的代谢半衰期,并对CYP450的重要亚型CYP3A4无明显抑制作用;小鼠急性毒性实验表明W13的半数致死剂量LD50大于3000 mg/kg,并对小鼠心、肝、脾、肺和肾器官无明显组织和形态学特征改变,安全性较高;大鼠药代动力学评价实验表明W13的口服生物利用度为64.5%,具有较好的成药性。第二部分借助PROTAC靶向蛋白降解技术,通过计算机辅助药物设计对VEGFR-2蛋白表面Lys残基区域进行分类,基于蛋白结构的合理药物设计策略,以化合物W13及其衍生物W27和W28为弹头,以VH032为VHL E3泛素连接酶配体抑制剂,通过不同碳原子数的烷二酸或烷基哌嗪侧链经酰胺化反应将两种配体相连,设计并合成了6个系列共计25个VEGFR-2-PROTACs降解剂分子,并对其体外细胞毒活性和HGC-27细胞中VEGFR-2蛋白降解活性进行评价。化合物P7表现出良好的体外HGC-27细胞抗肿瘤活性(IC50:2.03±0.17μM),中等的HUVEC细胞抗增殖活性(IC50:7.07±1.97μM),以及对人正常HEK293T和GES-1细胞较低的毒性(IC50:14.47±1.68μM和19.97±0.14μM),且对HGC-27细胞中的VEGFR-2蛋白具有较好的降解活性(DC50:0.084±0.04μM,Dmax:73.7%)。VEGFR-2降解机制表明,P7可以时间依赖性地对HGC-27细胞中的VEGFR-2蛋白产生快速有效的降解,并在更换新鲜培养液后24 h内保持持久的降解效力;P7通过形成三元复合物经泛素蛋白酶体（UPS）途径产生降解;P7可以明显缩短VEGFR-2蛋白合成的半衰期,并对其翻译和转录过程中VEGFR-2m RNA的表达没有影响,说明P7只对胞内现有的VEGFR-2蛋白有降解作用。细胞机制研究表明,P7可以时间和浓度依赖性地抑制HGC-27细胞的集落形成、细胞迁移和侵袭,并显著诱导HGC-27细胞凋亡和G2/M期周期阻滞。此外,P7在HUVEC细胞中具有较好的蛋白降解活性(DC50:0.51±0.10μM,Dmax:76.6%)。总之,本论文首先基于三维构象匹配的骨架跃迁设计策略,发现一种吲唑类VEGFR-2抑制剂,尤以W13表现出良好的抗胃癌活性、安全性和成药性,并进一步将其发展为VEGFR-2-PROTAC降解剂,其中P7通过形成三元复合物经UPS途径有效降解VEGFR-2蛋白。本论文的研究成果为VEGFR-2抑制剂和降解剂的设计和研发提供了新思路,更为抗胃癌药物的发现提供了新策略和实验积累。
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