据2012年世界卫生组织(WHO)数据统计,全世界环境空气污染每年造成约370万人过早死亡,而88%发生在中等收入和低收入国家,导致这种现状的主要原因是人群暴露于直径为10微米或更小的颗粒物质(PM1o)中。颗粒物的化学成分会随着地理位置、季节变化、产生来源的变化而改变,从而使其产生的毒性效应大不相同。已有的流行病学结果表明,颗粒物污染会对人群心肺系统产生有害影响,也会导致中枢神经系统疾病发生、住院和死亡率增高。已有的统计结果显示,人群生活环境中颗粒物污染严重程度与罹患中风(Stroke)和阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease)的几率成正比。在统计室内、外空气污染造成的死亡数据后发现,脑卒中分别达到总死亡率的34%和40%。而且污染地区人群肺组织和脑组织中炎症因子表达过高,易于促进神经退行性病变。因此,长期生活在大气颗粒物污染的地区或者典型性沙尘暴等突发急性污染事件所引发的健康问题显得尤为重要。由此,提出本课题的研究,探讨大气PM1o污染及其代表性多环芳烃对中枢神经系统的损伤效应。1.在本课题中,我们首先将采暖期的PM10制备成不同浓度(最终染毒浓度为：0.3、1、3和10mg/kg(体重))的悬液,对清洁级雄性Wistar大鼠进行气管注入染毒处理,研究PM1o对大鼠脑组织神经元的损伤效应。借助苏木精-伊红(htoxylin eosin. HE)染色和末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)染色观察大鼠脑组织病理学变化；采用酶联免疫技术(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定细胞因子的表达；利用反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)技术分别测定大鼠大脑皮层内皮、炎症、凋亡和突触可塑性相关因子在mRNA和蛋白水平的改变；并通过透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)观察突触超微结构变化。结果表明,在经过15天的PM1o暴露后(每3天1次,共5次),大鼠大脑皮层有轻微的病理学异常发生；同时伴随着内皮素(endothelin-1,ET-1)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)之间的平衡被打破；促炎症细胞因子白介素1β(interleukin 1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase, iNOS)和黏附分子(intercellular cell adhesion molecule, ICAM-1)的表达显著增加；PM1o暴露上调bax/bcl-2比率和抑癌基因p53表达水平,诱导神经元凋亡。另外,PM10暴露还显著刺激突触可塑性相关指标——突触素(synaptophysin,SYP)、突触后致密物(postsynaptic density protein 95, PSD-95)、NMDA受体2B亚型(NMDA receptor subunit,NR2B)、磷酸化胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase, p-ERK)和环磷腺苷效应元件结合蛋白(phosphorylated cAMP response element binding protein, p-CREB)的表达。由此提示,PM10暴露能诱导大鼠脑损伤,并呈现一定的浓度依赖效应,主要机制可能与内皮功能障碍及炎症反应相关。2.季节性的生产活动会导致PM10组成成分的不同,由此可能产生不同程度的健康影响。因此,在本研究中,我们将采集自不同季节(春、夏、秋、冬)的PM10样品制备成颗粒物悬液,对原代培养皮层神经元、神经元缺糖缺氧(oxygen glucose deprivation, OGD)模型和清洁级雄性Wistar大鼠(动物实验持续15天,每3天一次,共5次)进行染毒,并验证大气季节性PM1o污染与类缺血性中风损伤增加风险之间的相关性。我们借助TUNEL染色和免疫荧光染色(immunofluorescent staining, IF)观察组织病理学变化；采用酶联免疫技术测定细胞因子的表达；利用RT-PCR和Western blot技术分别测定大脑皮层内皮、炎症、凋亡和突触可塑性相关因子在mRNA和蛋白水平的改变；并通过TEM观察突触超微结构变化；最后,对不同季节PM10样品诱导的类缺血性损伤和理化特性进行相关性分析。结果表明：不同季节PM10染毒可诱导原代培养皮层神经元炎性标记物(iNOS、COX-2和ICAM-1)表达；增加磷酸化Ca2+／钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα (phosphorylated Ca2+/calmodulin dependent protein kinase Ⅱα,p-CaMKⅡα)和p-CREB的蛋白水平；并诱发即早基因(immediately early gene, c-jun和c-fos)的高表达。同时,增加原代培养皮层神经元OGD模型的易感性,并呈现明显的季节效应。另外,不同季节PM10样品也能导致大鼠脑组织病理学损伤,诱导神经元凋亡加剧,引发内皮功能障碍、炎症反应,以及随后的突触损伤,诱导神经功能障碍。相关分析结果表明：以较高的多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)含量为特征的冬季PM10样品,可以明显的诱导类缺血性脑损伤,这意味着大气PM10暴露可能是促成脑缺血性损伤发展和恶化的原因之一。3.作为典型的多环芳烃类物质,苯并芘(Benzoapyrene, BaP)是一种广泛分布的环境污染物。除了广为人知的免疫毒性和致癌性,更多的数据证实BaP具有神经毒性,尤其是对神经行为学和认知功能具有严重影响。在本实验中,我们使用体外原代培养皮层神经元和体内动物模型(动物实验持续7天,每天一次,共7次)来探讨BaP及其代谢产物环氧苯并芘(Benzoapyrene diol epoxide, BPDE)诱导的神经元损伤。我们借助TUNEL染色观察神经元凋亡；利用荧光探针2,7---氯乙酰乙酸盐(2’7’-dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)检测法测定活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平；采用酶联免疫技术测定前列腺素(PGs)和环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)表达；利用Western blot技术分别测定大脑皮层COX-1/COX-2、caspase-3和EP2/4受体蛋白表达变化。实验结果表明：BaP诱导的神经毒性效应可能是通过刺激COX-2及其代谢产物的表达增加来调控的。另外,BaP诱导的神经元损伤效应能被抗氧化剂、COX-2抑制剂(NS398)、EP2和EP4拮抗剂(AH6809和AH23848)、PKA阻断剂(KT5720和H89)明显的抑制,这在一定程度上说明BaP对COX-2的激发作用是从自由基攻击开始的。随后,通过COX-2衍生的前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)及其作用的EP2/EP4受体和环磷酸腺苷／蛋白激酶A(cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A,cAMP/PKA)信号通路来调控的。本研究揭示了PM1o及BaP对大脑神经元的损伤效应,其分子机制与氧化损伤、内皮功能障碍、炎症反应、细胞凋亡、突触可塑性等相关。同时建立了对PM1o及BaP污染进行检测和危险度评价的生物标记,为污染地区中枢神经系统疾病的预防、早期诊断和临床治疗提供一定的实验依据。