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腺病毒(adeno virus, Ad)载体具有感染宿主范围广、转导效率高和不易引起插入突变等优点,因此广泛应用作基因治疗和基因工程疫苗的载体,但现有的重组腺病毒制备方法具有费时、成本高、不易规模化等缺点。受体结合捕获(receptor-binding capture)技术能从组织和环境样品中浓缩病毒,将其与PCR等技术相结合可用于病毒的浓缩和环境监测。类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)是一种人工合成的蛋白聚合物,具有温度敏感相变特性,即随着溶液温度的变化由可溶性状态变为不可溶凝聚状态,已广泛用作重组蛋白的纯化标签。将ELP的温度敏感相变特性与柯萨奇病毒-腺病毒受体(coxsachievirus and adenovirus receptor, CAR)结合腺病毒的特异性相结合,用重组大肠杆菌表达的ELP-CAR融合蛋白有望建立简单、快速、经济的腺病毒浓缩与纯化方法。奶牛乳房炎严重地制约着奶牛业的发展,目前一般采用抗生素防治。但奶牛乳房炎的病原种类复杂,中小型奶牛场一般不进行病原菌鉴定和药物敏感性检测,长期、盲目使用抗生素不仅治疗效果不佳,而且药物残留和耐药菌株日益严重。溶菌酶是一种细胞壁溶解酶,对多种革兰氏阳性菌具有直接溶菌作用,在补体等体液因子参与下对革兰氏阴性菌也有一定的溶菌作用,表达溶菌酶的重组质粒对奶牛乳房炎具有良好的防治效果。γ干扰素(IFN-γ)是一种高活性、多功能细胞因子,能提高机体的免疫和抗感染能力,重组大肠杆菌表达的牛丫干扰素对奶牛乳房炎也有一定的治疗效果。因此,溶菌酶与BoIFN-γ共表达重组腺病毒对奶牛乳房炎可能具有更好的治疗效果。一、ELP-CAR融合蛋白的表达与纯化：依次将ELP、CAR间隔区和CAR D1区编码序列插入原核表达载体pET-30a,将重组质粒pET-ELP-CAR转化BLR(DE3)大肠杆菌,在20℃利用IPTG诱导融合蛋白表达,在优化条件下利用ELP的温度敏感逆向相变循环(ITC)纯化融合蛋白。结果显示：ELP-CAR融合蛋白在重组大肠杆菌中获得可溶性表达,第一轮逆向相变循环获得的融合蛋白纯度为89.4%,再次逆向相变循化后的纯度达94.5%。Western-blot鉴定结果显示：纯化的ELP-CAR融合蛋白能被CAR抗体识别。这些实验结果表明,本研究成功纯化出了ELP-CAR融合蛋白。二、腺病毒快速浓缩与纯化方法的建立：将rAd-GFP与ELP-CAR融合蛋白混合,4℃孵育1h后用ITC沉淀,经PCR检测证明rAd-GFP能被ELP-CAR融合蛋白结合和沉淀。将不同浓度ELP-CAR融合蛋白与rAd-GFP在不同温度、pH条件下孵育不同时间,用ITC回收结合的rAd-GFP,病毒滴定结果显示120mg/ml的ELP-CAR与rAd-GFP在18℃、pH7.0孵育30min的结合效率最佳。将结合融合蛋白的rAd-GFP在不同温度、pH条件下洗脱不同时间,病毒滴定结果显示最佳洗脱条件为20℃、 pH9.0、10min。在优化条件下分别从rAd-GFP感染细胞培养上清和裂解细胞中纯化重组腺病毒,结果显示rAd-GFP的获得率分别为76.2%和73.3%。在优化条件下洗脱从rAd-GFP感染细胞培养上清和裂解细胞纯化的rAd-GFP,结果显示回收率分别30.6%和34.5%,与高压液相色谱和氯化铯密度梯度的回收率相当。分别用结合ELP-CAR融合蛋白和洗脱的rAd-GFP感染CAR阳性PK-15细胞、CAR弱阳性CHO-K1细胞和CAR阴性NIH 3T3细胞,荧光显微镜观察结果显示洗脱和未洗脱重组腺病毒均能感染PK-15和CHO-K1细胞,不能感染NIH 3T3细胞。用含或不含10%犊牛血清的细胞培养液稀释洗脱和未洗脱重组腺病毒,分别感染PK-15和CHO-K1细胞,流式细胞仪计数结果表明洗脱和未洗脱重组腺病毒均能有效转导PK-15细胞,而且受犊牛血清的影响较小；对于CHO-K1细胞,洗脱腺病毒的转导效率显著高于未洗脱重组腺病毒,而且受犊牛血清的影响较大。将不同浓度rAdv-GFP接种自来水和PBS,然后加入ELP-CAR融合蛋白,孵育一定时间后用ITC回收,荧光定量PCR检测结果表明ELP-CAR融合蛋白从PBS和自来水中捕获病毒的效率分别为74%和63%。三、双表达腺病毒载体的构建：用化学合成或PCR扩增脑心肌炎病毒(EMCV)、Gtx同源异型蛋白(Gtx)、人蛋白翻译起始因子4G (EIF4G)、人胶原诱导蛋白(hVCIP)和鼠胶原诱导蛋白(mVCIP)的内部核糖体进入位点(IRES),测序鉴定正确后分别插入腺病毒载体pShuttle-CMV,构建获得双表达腺病毒载体pShuttle-IRES.分别以含人溶菌酶(hLYZ)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒为模板,用PCR扩增LYZ和GFP基因,分别插入pShuttle-IRES载体IRES位点的上游和下游,获得5种重组载体pShuttle-LYZ-IRES-GFP。分别用脂质体转染法将5种重组载体转染PK15、AAV-293、 CHO-K1和MDBK细胞,用流式细胞术等检测GFP阳性细胞及荧光强度,结果表明EIF4G IRES能在四种不同细胞中有效表达下游GFP基因。四、溶菌酶与γ干扰素共表达重组腺病毒的制备及表达检测：根据BoIFN-y编码序列设计引物,两端分别引入XhoⅠ、HindⅢ酶切位点,以pGEX-IFNγ质粒为模板PCR扩增BoIFN-γ序列,PCR产物经XhoⅠ和HindⅢ酶切消化后,取代pShuttle-LYZ-EIRES-GFP中的GFP编码序列,获得共表达重组腺病毒载体pShuttle-LYZ-EIRES-IFNy,用常规构建方法转化大肠杆菌获得同源重组质粒,转染AAV-293细胞获得重组腺病毒。电镜观察结果表明：重组病毒rAd-LYZ-IRES-IFN具有典型的腺病毒形态,PCR能从其基因组DNA中扩增到预期的461 bp hLYZ基因片段和509bp BoIFN-y基因片段。用重组腺病毒感染PK-15细胞,经RT-PCR和间接免疫荧光法检测证明,重组腺病毒能正确表达hLYZ和BoIFNy蛋白。