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中性蛋白酶是最早被人类应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一,由于其作用条件温和,催化速率较高,被广泛应用于食品、医药、皮革、饲料、化工和废弃物处理行业中。本文在土壤中分离得到一株产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌ZG20;通过改变培养基成分及培养条件,对ZG20进行了发酵条件优化研究,并对粗酶液进行了分离纯化和酶学性质的研究。主要研究如下:(1)在鸽子广场采集的土样中分离得到一株能较好产生中性蛋白酶的耐高温菌株,经形态学、生理生化鉴定及分子生物学鉴定,确定为蜡样芽孢杆菌,并将其命名为ZG20。(2)对ZG20菌株进行发酵条件优化试验。通过单因素实验及Plackett-Burman试验,确定影响中性蛋白酶活力的关键因子为葡萄糖浓度,蛋白胨浓度和pH。在此基础上,进行响应面试验,得到预测值后,进行验证试验。试验结果表明,ZG20菌株的最佳培养基组分为:葡萄糖35 g/L,蛋白胨40.38 g/L,氯化钠15 g/L,硫酸镁15 g/L,Tween-80为10 g/L;最佳培养条件为:pH7.15,接菌量5%,装液量50mL/250mL,菌龄12h,发酵时间36h,此时酶活力为698.41 U/mL,为初始发酵培养基酶活的1.77倍。(3)对发酵粗酶液进行分离纯化及相关酶学性质研究。对不同饱和度硫酸铵沉淀的中性蛋白酶进行回收,透析并浓缩后,通过Cellulose DE-52阴离子交换柱和Sephadex-G100凝胶过滤柱进行分离纯化,以SDS-PAGE蛋白电泳检验中性蛋白酶纯度及分子量大小。分离纯化试验及相关酶学性质研究试验结果表明:该中性蛋白酶分子量约为29kDA;最适作用pH值和温度分别为7和45℃;在0.05mol/L的过氧化氢中有较好的稳定性。Mg2+、Zn2+、K+、Na+对该蛋白酶有较大的促进作用,Cu2+、Fe2+、、Ca2+对该酶影响不大,Mn2+、Al3+、Co2+、Ni2+有较大的抑制作用。Tween-80对该酶有促进作用,随着Tween-80浓度的升高,对该酶的促进效果表现地更为明显;SDS、EDTA、TritionX-100对该酶有不同程度的抑制作用,EDTA的抑制作用最为明显。该中性蛋白酶有一定的耐乙醇、乙二醇、丙三醇等有机溶剂效果,对酪蛋白、牛血清蛋白、明胶、鸡蛋清、奶粉均有一定降解作用,对酪蛋白的降解作用最为明显。绘制了该蛋白酶的酶反应动力学,计算得到 Km值为 12.74mg/mL,Vmax值为 28.57 μg/(min·mL)。