论文部分内容阅读
鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)引起的一种自然疫源性疾病。鼠疫菌在传播环节中宿主动物的改变以及致宿主病变的过程中，受到诸多环境信号，比如抗菌肽、温度、pH、渗透压等的刺激，鼠疫菌能感应这种复杂的信号刺激并自我调节，产生毒力因子，最终使鼠疫菌得以存活。鼠疫菌自我调节机制中，转录调控子对靶基因在转录水平上的调节至关重要。PhoP和RovA是鼠疫菌重要的毒力调控因子，pH6抗原是鼠疫菌重要的毒力相关因子，它们之间联系至今并未被阐明。
PhoP是二元调节系统PhoP-PhoQ的调节蛋白，PhoP-PhoQ系统能够感应低Mg2+、微酸性环境以及抗菌肽的刺激信号，从而激活PhoP蛋白的转录调节活性，上调或下调靶基因的转录。本实验室前期研究发现，鼠疫菌PhoP蛋白是整体调控子，表达谱结果表明，在低Mg2+条件下，有706个基因的转录受PhoP的影响，包括pH6抗原基因、PhoP-PhoQ系统及rovA基因。
小肠结肠炎耶尔森氏菌rovA缺失株对小鼠毒力下降，表明RovA是其重要的毒力调控因子。RovA能以二聚化的形式结合到靶基因启动子区调控基因转录，在小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌中，它不仅能激活侵袭因子基因inv的表达，还能激活自身的表达以及其他毒力相关基因的表达。在鼠疫菌中，也有学者进行了RovA的芯片表达谱分析，发现RovA是一个全局性毒力调控因子，能调控数十个基因的表达，包括pH6抗原基因，但是详细调控机制还没见报道。
鼠疫菌pH6抗原由基因簇psaEFABC编码，其中psaABC编码结构亚单位(A)及其伴侣蛋白(B)和膜引领蛋白(C)；而psaEF表达产物可能对psaA的转录调控有关。pH6抗原最高表达是在环境pH=6、温度在34℃或更高条件下实现，且只有在34℃以上才能发挥毒力效应。pH6抗原是鼠疫菌的毒力相关因子，与腺鼠疫的发生密切相关。
根据表达谱和生物信息学预测，在转录水平上，PhoP对psaA、psaE、自身操纵子基因以及rovA可能具有调控作用，同时RovA对自身基因及psaA、psaE的转录也可能具有调节作用。本研究的目的在于阐明上述调控子对可能的靶基因的调控机制。
我们基于Red系统分别构建了鼠疫菌phoP和rovA基因的突变株，利用大肠杆菌BL21λDE3的蛋白表达系统分别获得His-PhoP和His-RovA重组蛋白，再利用凝胶阻滞实验(EMSA)、DNase I足迹实验、β-半乳糖苷酶报告基因融合实验(LacZ实验)以及引物延伸实验等来详细研究PhoP和RovA对各自靶基因的转录调控机制。
实验结果表明：在低Mg2+、对数生长中期条件下，在转录水平上PhoP抑制psaA、psaE、rovA的表达，而激活自身操纵子基因YPO1635、phoP的转录；pH5.8、对数生长中期条件下，在转录水平上PhoP抑制psaA的表达，而对其它所研究基因无影响；在对数生长中期，RovA能激活psaA、psaE以及rovA的转录；在对数生长中期，psaA的转录受酸的调节，pH5.8较pH7.2条件下高表达，但是温度对其无影响。
在rovA基因启动子区发现了两个转录起始位点，分别命名为P1和P2，其中P1靠近翻译起始位点，它的转录启动受PhoP的抑制而受RovA的激活，P2只受RovA的激活而不受PhoP的影响；DNase I足迹实验表明RovA对自身启动子区有两个亲和力不等的结合位点site1和site2，前者亲和力高于后者，site1位于P2之前，因此我们认为site1控制着P2的转录，site2位于P1之后，推测RovA与site2的结合对rovA的转录具有负反馈调节作用，即RovA的自调控是双重性质的。
在psaE启动子区分别得到了PhoP和RovA的结合位点，并发现了三个距离很近的转录起始位点，PhoP的结合位点几乎覆盖了这三个位点，RovA的结合位点紧挨着PhoP结合位点位于其上游而远离转录起始位点，体内实验也证明，在特定条件下PhoP对psaE转录具有抑制作用，而对rovA具有激活作用。
PhoP和RovA对psaA启动子的结合位点互相重叠，都位于转录起始位点之后，体内实验表明，无论是高Mg2+还是低Mg2+以及酸性环境下，RovA对psaA的转录都具有促进作用，但足在低Mg2+和酸性条件下，PhoP对psaA的调控具有抑制作用，由此可见，PhoP和RovA通过竞争psaA启动子区相同的结合位点，共同调节psaA的转录。
低Mg2+条件下，YPO1635受PhoP的正调控在其它文献资料中已经得到验证，本文也证明了这种调控关系，同时也证明了PhoP确实正调控自身的转录，但足所发现的两个转录起始位点P1和P2，在细菌生长对数中期时只有P2是PhoP依赖性的。
综上，本研究利用分子生化试验手段，首次揭示了鼠疫菌中的PhoP-RovA-psa转录调控环路：RovA正调控psa位点和自身的转录；低Mg2+环境下，PhoP抑制psa位点和rovA的转录，而激活自身操纵子的转录，PhoP也能感应酸性信号，抑制psaA的转录；psaA的转录调节还受酸的调节，pH5.8较pH7.2条件下高表达，但是温度对其无影响。