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六价铬的应用广、危害大、涉及人群多且接触途径广泛,为研究其对大鼠睾丸及精原干细胞的损伤机制,我们通过体内实验结合体外实验建立六价铬暴露模型,探讨自噬在铬毒性中的作用,为进一步完善铬毒作用机制以及临床上铬中毒的治疗提供新的毒理学实验依据。目的:建立六价铬致大鼠睾丸和精原干细胞损伤的模型,探讨自噬在睾丸和精原干细胞损伤中的作用机制。方法:体内实验:32只雄性Wistar大鼠随机分为四组:对照组和低、中、高剂量重铬酸钾暴露组(0、0.4、0.6和0.8 mg/kg·bw重铬酸钾)。腹腔注射重铬酸钾,每周染毒5天,连续染毒5周,对照组给予等容积生理盐水。观察各组大鼠的一般情况。5周后,处死大鼠,HE染色观察组织病理学改变,火焰原子吸收光法检测睾丸组织铬含量,免疫组化法检测LC3B、LAMP1和LAMP2蛋白表达;Western blotting法(WB法)检测自噬相关蛋白MFN-2、PINKI、p-parkin、Beclin1和LC3B表达情况,免疫荧光化学法检测各组精原干细胞标志物CHD1阳性表达率。体外实验:分离大鼠的精原干细胞,流式细胞仪检测表面标志CDH1与核内标志OCT4的表达,诱导其分化生成精子,CCK8法检测六价铬的细胞毒性。以0.5、1.0和5.0 mmol/L的重铬酸钾浓度暴露处理24h,对照组给予等体积PBS。电镜下检测各组自噬水平,流式细胞仪检测各组线粒体数量变化,双免疫荧光法标检测MFN-2与LC3B蛋白表达,WB法检测各组MFN-2、PINK1、p-parkin、Beclin1和和LC3B蛋白表达。3-MA抑制细胞自噬后检测精原干细胞LDH释放值变化。结果:体内实验:对照组大鼠一般状态正常,而暴露组状态不佳。中剂量组大鼠睾丸脏器系数较对照组显著降低(P<0.05),高剂量组睾丸脏器系数较对照组、低剂量组、中剂量组都显著降低(P<0.05);原子吸收结果显示暴露组睾丸铬含量显著高于对照组,且随着铬暴露水平的升高,各组间差异有统计学意义(P<0.05);HE结果显示随着六价铬暴露的剂量增加,低剂量组睾丸组织生精小管内出现生精细胞层数和成熟精子减少的现象。中剂量组还出现了管周膜增厚、基底膜破碎、小管外间质组织出现充血等现象。高剂量组可见生精结构完全破坏,细胞或完全缺无或形成多核巨细胞现象。免疫组化与WB结果表明铬暴露组睾丸中自噬相关蛋白PINKI、p-parkin、Beclin1、LC3B、LAMP1和LAMP2的表达水平较对照组显著升高(P<0.05)。而各暴露组MFN-2的表达水平较对照组显著降低(P<0.05)。随着六价铬暴露剂量升高,精原干细胞标志物CDH1阳性率越来越低(P<0.05)。体外实验:细胞鉴定结果多数细胞CDH1和OCT4阳性,诱导可分化为精子。电镜结果显示暴露组自噬泡数量较对照组显著增多(P<0.05)。暴露组线粒体数量较对照组显著降低(P<0.05)。免疫荧光双染结果显示,暴露组MFN-2较对照组显著降低(P<0.05),LC3B表达阳性率较对照组显著升高(P<0.05)。精原干细胞各组WB结果与体内试验结果一致。LDH试验显示3-MA抑制剂作用后细胞毒性降低(P<0.05)。结论:体内实验:六价铬能够造成大鼠睾丸组织损伤,在本实验的剂量范围内,随着暴露剂量的增加自噬水平逐渐增高;线粒体自噬相关蛋白的表达随暴露剂量增高而逐渐增高。体外实验:六价铬能对大鼠精原干细胞造成损伤,在本实验的剂量范围内,随着暴露剂量的增加,自噬水平逐渐增高;线粒体自噬相关蛋白的表达随暴露剂量增高而逐渐增高。抑制自噬后,六价铬对精原干细胞的毒性降低。