核酶(ribozyme)是指具有催化活性的RNA分子，它们可以从前体mRNA中自我剪接并连接两侧外显子。目前，自我剪接的核酶主要包括两种：Ⅰ组内含子和Ⅱ组内含子。Ⅰ组内含子的二级结构主要包括10个配对区。它们的自我剪接需要一个鸟苷酸辅助完成，其典型反应是包括两步磷酸酯键转移的RNA剪接反应。典型的Ⅱ组内含子的二级结构是由六个茎环结构域组成(结构域Ⅰ-Ⅵ)的，其中结构域Ⅳ环区包含一个开放阅读框架(ORF)。它能编码多功能蛋白质，该蛋白质一般具有反转录酶、成熟酶和核酸内切酶三种活性。这些活性对Ⅱ组内含子的剪接和移动都起着非常重要的作用。Ⅱ组内含子的自我剪接与Ⅰ组内含子的差别在于其转酯反应无需游离鸟苷酸发动，而是由内含子靠近3’端的突起腺苷酸残基引发的。经过两次转酯反应，内含子成为套索结构被切除，两侧外显子则连接到一起。　　 本论文第一部分是在大肠杆菌中研究海洋蓝细菌Nostoc punctiforme基因组中的一个Ⅰ组内含子的剪接机理。N.punctiforme的核糖核酸还原酶(RIR)基因上包含一个Ⅰ组内含子，它的序列长383个碱基，并包含一段新的插入序列。已经证明这个内含子在大肠杆菌中能够发生自我剪接反应，而且剪接活性很高。本实验室首先将NpuRIR内含子的全部序列插入pDrive质粒载体的卡那霉素抗性基因(KanR)内，构建了pKR-12质粒。然后将它转化大肠杆菌，发现在含有卡那霉素的LB平板上不能生长，说明NpuRIR内含子不剪接，可能是因为内含子不适应KanR基因。为了获得能够适应外源基因的内含子，试验中首先给内含子引入随机突变，然后通过功能筛选来达到对其定向进化的目的。本课题主要采用易错PCR的方法对NpuRIR内含子进行随机突变，成功获得大量突变了的NpuRIR内含子，然后构建了重组质粒突变库。将大量重组质粒转化大肠杆菌DH5α后，在含有(20μg/ml)卡那霉素的平板上获得42个单菌落。再经过PCR、质粒提取、酶切、连接和转化后，初步筛选得到1个带有突变并具有卡那霉素抗性的克隆。经过RT-PCR鉴定此克隆中内含子确实具有剪接活性。这部分工作的成果是对内含子的剪接活性继续进行定向进化以获得能够适应各种外源基因的内含子突变的基础，也深入研究碱基突变位点与内含子剪接机理的联系提供了实验证据。　　 本论文第二部分初步探索了Trichode smiumery thraeum基因组中编码DNA聚合酶Ⅲ的β亚基的基因上第一个Ⅱ组内含子的归巢机制。实验室已经构建了含有TerdnaN-1内含子序列的供体质粒pDN1-C，在内含子序列中包含KanR基因的序列，这个载体上还含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的序列。而后又构建了含有TerdnaN-l内含子的天然插入位点的受体质粒pAM1-H2，这个载体上包含了氯霉素抗性基因(CamR)。通过电转化将两种表达载体pAM1-H2和pDN1-C导入大肠杆菌，筛选得到双质粒菌株，再经过多次生长条件的摸索(如溶氧)，最终获得了能够稳定正常生长的含有双质粒的大肠杆菌菌株。经过诱导表达，提取诱导后细胞的总质粒DNA，用限制性内切酶去除混在总质粒DNA中的供体质粒。经过纯化，将所得DNA(可能含有归巢后的质粒DNA，即内含子插入受体质粒归巢位点后形成的)转化大肠杆菌，通过含有卡那霉素和氯霉素两种抗生素的LB平板筛选。分别提取平板上所长菌落的质粒DNA，然后在归巢位点的上下游设计引物进行PCR，经过琼脂糖凝胶电泳分析，尚未检测到目的条带。可能是由于归巢的发生频率较低，不容易被检测到。不过两株含有双质粒的大肠杆菌的成功获得，为进一步深入研究海洋蓝细菌归巢甚至移动机制提供了前提条件。根据细胞器内共生起源学说，蓝细菌是叶绿体的祖先，因此本课题的研究也可能为叶绿体的起源和进化提供一些证据。