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背景与目的B淋巴细胞肿瘤是一类主要为B淋巴细胞起源的恶性疾病,包括B-ALL、B-NHL及大多数的CLL等。其中B系急性淋巴细胞白血病(B-linage acute lymphocytic leukemia, B-ALL)是表达早期白细胞分化抗原的恶性克隆性疾病,其发病率在儿童及成人恶性肿瘤中均较高。慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia, CLL)是一种主要为B细胞起源的单克隆性小淋巴细胞恶性疾病,在欧美国家是最为常见的白血病类型,而在我国发病率也逐年增加。B淋巴细胞肿瘤的肿瘤细胞膜表面可表达CD20、CD52,利妥昔单抗(Rituximab, RTX)和阿伦单抗(Alemtuzumab, ALM)是分别针对CD20与CD52的靶向治疗单克隆抗体,较传统的化疗药物相比具有明显的低毒、目标性强等优势,已经应用于临床治疗B淋巴细胞肿瘤并取得了一定的效果,但并没有达到人们预期中理想的治疗反应,尤其是单独应用利妥昔单抗或阿伦单抗治疗B淋巴细胞肿瘤时疗效有限,其机制可能与特异性亚克隆种群的存在及免疫下调有关。由于缺乏糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚区的特异性CD52(-)亚克隆种群的存在,在多数情况下发现当阿伦单抗有效地根除CD52(+)肿瘤细胞时,CD52(-)亚克隆种群逃避了靶向治疗；同时,由于CD20(+)的肿瘤细胞对利妥昔单抗反应性表达下调,利妥昔单抗在杀灭细胞表面表达CD20的肿瘤细胞时同样显示出有限的治疗效应,其中一部分CD20(+)肿瘤细胞被清除,而另一部分细胞表面的CD20表达反应性下调或转化为CD20(-)的肿瘤细胞。Chu等和Alvaro-Naranjo等的研究证实利妥昔单抗治疗前后CD20(+)与CD20(-)的恶性B淋巴细胞为同一克隆起源；Davis等报道检测也表明初治时CD20(+)与复发时CD20(-)肿瘤细胞的lgvH互补决定区(Complemon tarity determining regions, CDR)的同源性为100%。值得关注的是,在体内单独应用阿伦单抗后出现的CD52(-)的淋巴细胞,是因为阿伦单抗在体内的存在提供了一种选择压力,使得本来数量极少的GPI基因突变的造血细胞获得了相对的“生长优势”,逃避了靶向治疗的CD52(-)肿瘤细胞不仅没有受到抗体影响反而快速增殖。这是一种在医学界经常出现但我们却无法从其根本改变的肿瘤细胞耐药机制。然而,国外研究也发现,缺乏GPI锚区的CD52(-)亚克隆细胞在体内通过补体依赖的细胞毒作用对利妥昔单抗表现出增强的敏感性；同时,阿伦单抗对那些因利妥昔单抗治疗而引起的细胞表面CD20反应性表达下调或转化为CD20(-)的肿瘤细胞亦有明显的杀伤、抑制作用。如果细胞表面分化相关抗原CD20与CD52在B淋巴细胞表面可以共表达(即联合表达),那么我们就可以充分利用上述利妥昔单抗及阿伦单抗在治疗B淋巴细胞肿瘤的“互补作用机制”,联合应用两种单克隆抗体,避免单独应用利妥昔单抗或阿伦单抗时出现的肿瘤细胞耐药机制,使二者在生物体内体现出完整有效的治疗效应。基于以上资料,我们提出在B淋巴细胞肿瘤中联合应用上述两种单克隆抗体的治疗理论。本实验在于应用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)研究B淋巴细胞肺瘤的肿瘤细胞表面分化相关抗原CD20、CD52的表达,观察CD20与CD52在B淋巴细胞肿瘤的肿瘤细胞表面共表达的水平,为在以后的临床中联合应用Rituximab和Alemtuzumab两种靶向治疗单克隆抗体提供理论基础,为治疗B淋巴细胞肿瘤提供新的策略。材料与方法1研究对象实验组：(1)初治B系急性淋巴细胞白血病(B lineage Acute Lymphoblastic Leukemia, B-ALL)组：45例；男23例,女22例,中位年龄39(14-58)岁。(2)慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia, CLL)组22例；男12例,女10例,中位年龄60(55-76)岁。正常对照组(control):10例骨髓象正常的非恶性血液病患者或造血干细胞供者；男6例,女4例,中位年龄32(15-56岁)。所有研究对象取自2011年2月至2011年12月郑州大学第一附属医院血液内科住院或门诊病例。所有患者经血常规,骨髓细胞形态学、免疫学、细胞遗传学以及分子生物学检查确诊。诊断标准参考张之南《血液病诊断及疗效标准》,第三版。2实验方法应用流式细胞术(FCM)检测骨髓细胞CD20、CD52的表达水平。对研究对象行骨髓穿刺术抽取骨髓液标本,应用膜抗体标记法,以CD20-FITC/CD52-PE/CD45-Pc5作为三色免疫分型抗体组合,采用流式细胞仪附带软件进行数据采集分析,以10例骨髓象正常的非恶性血液病患者或造血干细胞供者的骨髓细胞CD20、CD52的表达水平为对照。3数据统计应用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析。定量资料用平均值±标准差(x±SD)表示：两独立样本均数的比较采用t检验。定性资料采用卡方检验(包括Fisher’s精确概率试验)。相关性分析采用Spearman相关性分析。以p<0.05为差异有统计学意义。结果1. CD20、CD52在初治B-ALL中的表达45例初治B-ALL组CD20阳性率明显高于对照组,但差异无统计学意义(x2=2.065,p=0.151)；与对照组比较,CD52阳性率差异亦无统计学意义(x2=2.432,p=0.119)。2. CD20、CD52在初治B-ALL中的共表达及相关性分析45例初治B-ALL组经流式细胞术检测CD20、CD52表达,其中CD20+CD52+双阳性17例(37.8%),与对照组相比差异有统计学意义(p=0.041),CD20-CD52-双阴性患者20例(44.4%),CD20+CD52-和CD20-CD52+患者共8例(17.8%)。二者表达具有相关性(x2=20.372,p＜0.001)；相关系数r=0.673。3. CD20、CD52在CLL组中的表达22例CLL组CD20阳性率显著高于对照组,且差异有统计学意义(x2=10.057,p=0.002)；与对照组比较,CD52阳性率差异亦有统计学意义(x2=10.641,p=0.001)4. CD20、CD52在CLL中的共表达及相关性分析22例CLL组中CD20+CD52+双阳性15例(68.2%),与对照组相比差异有统计学意义(p=0.016),CD20-CD52-双阴性患者1例(4.5%),CD20+CD52-和CD20-CD52+患者共6例(27.3%)。二者表达具有相关性(x2=6.617,p=0.015)；相关系数r=0.711。5. CD20与CD52双阳性在不同的B淋巴细胞肿瘤中表达的比较分析22例CLL组与45例初治B-ALL的CD20+CD52+双阳性差异有统计学意义(x2=5.547,p=0.019)6. CD20在B-ALL中的表达与临床特征的关系CD20的阳性表达率与初治B-ALL组患者的年龄、性别及有无髓外浸润(患者有肝脾大、淋巴结肿大、牙龈肺胀、中枢神经系统白血病等)等临床特征无明显相关性(p>0.05)。结论1.CLL组CD20、CD52表达显著高于正常对照组,CD20、CD52可作为CLL的治疗靶点。2. CD20、CD52在B淋巴细胞肿瘤中联合高表达。3. CD20、CD52的共表达在不同B淋巴细胞肿瘤中具有差异性。4.可以在B-ALL、CLL等B淋巴细胞肿瘤的治疗中联合应用抗CD20、CD52两种单克隆抗体。5.CD20阳性是利妥昔单抗应用与否的唯一依据。