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本课题以人参药材为原料,较系统地研究了人参多糖的提取分离工艺,采用体内外免疫活性测定方法筛选人参多糖的免疫活性部位,对免疫活性部位进行初步的结构分析,并建立质量标准(草案),为人参多糖的深入研究和相关制剂的开发奠定基础。一、人参多糖提取分离工艺以多糖提取率和多糖分子量为指标,比较水提、酸提和碱提的效果,通过正交试验优选人参多糖的最佳提取工艺为:人参药材中加15倍量水,100℃提取3次,每次3 h。以蛋白清除率、多糖保留率和多糖分子量为指标,比较Sevag法和TCA法的除蛋白效果,通过正交试验优选人参多糖的最佳除蛋白工艺为:5%人参粗多糖溶液中加1/3倍体积的Sevag试剂(V氟仿:V 正丁醇=4:1),重复操作5次。人参粗多糖经除蛋白后得到除蛋白人参多糖(GP)。GP经Q-Sepharose FF色谱柱分离后于水洗脱部位得到中性多糖GPN,0.3 mol/LNaCl溶液洗脱部位得到酸性多糖GPA,GPA经Q-Sepharose FF色谱柱分离,依次在水、0.1、0.2和0.3 mol/LNaCl溶液洗脱部位得到酸性不同的组分GPA-1、GPA-2、GPA-3和GPA-4。用 Sepharose CL-6B 分子筛色谱柱将 GPN、GPA-1、GPA-2、GPA-3 和 GPA-4 进一步分离得到 11 个组分:GPN-1、GPN-2、GPA-1-a、GPA-1-b、GPA-2-a、GPA-2-b、GPA-3-a、GPA-3-b、GPA-3-c、GPA-4-a 和 GPA-4-b。二、人参多糖不同组分免疫活性研究体内实验结果表明,人参多糖对小鼠的非特异性免疫和特异性免疫均具有一定的调节作用,中性多糖作用强于酸性多糖,具有显著性作用的组分为GPN-2。体外实验结果表明,GPN-2、GPA-2-a、GPA-2-b、GPA-3-b、GPA-3-c、GPA-4-a、GPA-4-b均具有体外刺激脾淋巴细胞增殖和促进腹腔巨噬细胞吞噬能力的作用。综合体内、体外免疫试验结果可知,人参多糖经分离纯化后,免疫活性部位与非活性部位得到分离,人参多糖中具有免疫活性增强作用的组分有GPN-2、GPA-2-a、GPA-2-b、GPA-3-b、GPA-3-c、GPA-4-a 和 GPA-4-b。三、人参多糖免疫活性效应组分的结构表征采用紫外光谱、高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)、毛细管电泳法、红外光谱对人参多糖免疫活性组分的纯度、分子量、单糖组成及摩尔比进行了考察,结果如下:GPN-2为白色絮状固体,无臭。多糖含量为87%,不含糖醛酸和蛋白质。非均一组分,重均分子量为4.8×104,主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成,其摩尔比为1:0.04:0.49:0.74,经红外光谱分析由α-吡喃糖苷键连接。GPA-2-a为淡黄色粉末,无臭。多糖含量为85%,糖醛酸含量为6%,不含淀粉和蛋白质。非均一组分,重均分子量为1.5×105,主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成,其摩尔比为1:0.14:0.65:0.71:1.28:0.13,经红外光谱分析由α-吡喃糖苷键连接。GPA-2-b为黄色粉末,无臭。多糖含量为75%,糖醛酸含量为4%,不含淀粉和蛋白质。非均一组分,总计重均分子量为7.3×103,主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成,其摩尔比为1:0.09:0.25:0.43:1.06:0.14,经红外光谱分析由α-吡喃糖苷键连接。GPA-3-b为淡黄色粉末,无臭。多糖含量为40%,糖醛酸含量为53%,不含淀粉和蛋白质。非均一组分,总计重均分子量为5.8×104,主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成,其摩尔比为1:3.05:12.00:10.87:16.72:10.80。GPA-3-c为黄色粉末,无臭。多糖含量为42%,糖醛酸含量为64%,不含淀粉和蛋白质。非均一组分,总计重均分子量为1.7×104,主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成,其摩尔比为1:0.43:1.54:1.10:9.90:4.31。GPA-4-a为淡黄色粉末,无臭。多糖含量为46%,糖醛酸含量为91%,不含淀粉和蛋白质。非均一组分,总计重均分子量为1.1×105,主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成,其摩尔比为1:2.14:2.78:2.21:20.76:1.80。GPA-4-b为黄色粉末,无臭。多糖含量为39%,糖醛酸含量为72%,不含淀粉和蛋白质。非均一组分,总计重均分子量为1.4×104,主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成,其摩尔比为1:1.28:8.39:6.67:14.05:1.59。四、人参多糖GPN-2组分质量标准研究在GPN-2制备工艺稳定的基础上,建立了 GPN-2的质量标准(草案),包括性状、鉴别、检查、含量测定、分子量测定等内容,规定GPN-2的含量以无水葡萄糖(C6H1206)计,含量不得少于80.0%,分子量分布范围暂定为:3.0×104～6.0×104。