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牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis，简称Pg)是牙周炎的重要优势致病菌，牙龈蛋白酶是P.gingivalis的重要致病因子。牙龈蛋白酶K(gingipain K，简称KGP)基因全长由6.4Kbp组成，前22个氨基酸为信号肽，接下来23～229残基是N-端前序列，230～739个氨基酸为成熟肽蛋白酶结构域(KGPcd)，740～1723的氨基酸为β亚单位即凝集素结构域。KGPcd为KGP的生物活性部分，β亚单位其保守的位点几乎存在于所有P.gingivalis，并具有粘附、凝集功能。由于近年来分子生物学和免疫学的发展，牙龈蛋白酶基因已被克隆和测序，对其蛋白质分子中的各个功能区、抗原表位及相应的编码基因片段已有了更深入的了解，为研制疫苗提供了可靠的依据。 本课题为研究基因免疫在预防牙周炎中的作用，采用分子生物学技术，对P.gingivalis KGPcd进行了克隆、原核表达和纯化，并制备了抗KGPcd抗体；同时构建KGPcd真核表达质粒，并免疫SD大鼠，观察其在防治牙周炎中的作用，实验结果表明：KGPcd可作为基因候选疫苗，有减缓牙槽骨吸收的作用，这为今后进一步研究预防牙周炎的基因疫苗奠定了实验基础，为控制牙周炎的发生提供一种新型的预防方法。本研究分为以下二部分：第四军医大学博十学位论文lpgingivalisKGpcd的基因克隆、表达、纯化及抗体制备1.Ik即cd基因克隆及其序列分析 采用细菌基因组DNA抽提试剂盒从尸gi眼ivalis ATCC 33277中提取DNA组，然后利用PCR技术，从尸gtngivalis ATCC 33277 DNA组中扩增人邵，cd的基因片段(1467bp)，将所得的基因片段与克隆载体pGEM一T easy Vector连接，转化大肠杆菌E.coli XL一10并进行蓝白筛选，随机挑选数个克隆，提取质粒DNA，通过限制性酶切和核普酸序列分析鉴定。结果表明:其序列与GeneBank核酸数据库中收录的尸gl’ngl’vall’s 381的切，cd的序列完全一致。因此通过PCR方法从尸gl’ngtvalis ATCC 33277基因组中成功获得了及霎，cd基因片段。1.2 KGPcd在大肠杆菌中的表达 将编码KGPed的基因片段克隆到原核表达载体pET-16b上，使其受控于T7启动子，构建表达质粒pET- 1 6b/k即cd，以大肠杆菌E. coliBL21(DE3)为宿主菌，用IPTG诱导其表达，优化IPTG诱导浓度与诱导时间，并进行蛋白表达形式分析，然后进行大量诱导表达，表达产物用镍金属鳌合柱纯化，采用稀释加透析方法进行复性处理。再以抗His标签抗体通过认飞stem blot检测纯化的蛋白。结果表明:经IPTG诱导后，工程菌在SDS一PAGE上出现一条新蛋白带，分子量与预期大小一致(约56kDa)。在IPTG不同浓度，不同时间的诱导条件下，对融合蛋白表达量影响不大，表达量差异不明显。表达形式分析证实表达的融合蛋白主要以不溶形式存在于包涵体中。经裂菌、洗涤后，SM尿素溶解，过Ni一SePhrose亲和层析并经透析复性。结果获得了高纯度融合蛋白His一KGPed，其分子量与预期相符。Westem blot结果也进一步证实纯化的蛋白为His一KGPed融合蛋白。1.3抗KGped抗体的制备 以重组、纯化的KGPed蛋白为抗原，与等体积弗氏佐剂充分乳化后，免疫新西兰大白兔，制备KGPcd的多克隆抗体，将获得的多第4页第四军医大学博士学位论文克隆抗血清初步纯化，并用ELASA法检测抗体效价，用认乞Stem blot鉴定抗血清的特异性。结果表明:抗体效价为1:6400，抗血清能够与KGPcd发生特异性反应，抗体仅特异识别目的蛋白。多克隆抗KGPcd抗体的获得为后续研究奠定了基础。2 KG子七d基因疫苗的制备及预防牙周炎的实验研究2.1真核表达质粒的构建及其在哺乳动物细胞中的表达 取纯化的真核表达载体PcDNA3.1(+)及pGEM一T/kgl，cd酶切、回收、连接，转化至E.colt XL一10感受态细胞中，对阳性菌落提取质粒并进行酶切鉴定，并鉴定插入片断的方向，以构建人岁，cd真核表达质粒PcDNA3.1+/k即cd。重组质粒构建成功后采用脂质体Lipofectamine2000介导的瞬时转染贴壁细胞的方法，瞬时转染COS7细胞，然后用间接免疫荧光、Westem blot两种法证实重组质粒PcDNA3.1+/kgl，cd在哺乳动物细胞中的表达情况。结果表明:重组质粒PcDNA3 .1(+)/人{〔牙尸cd转染COS7细胞后目的基因能够在细胞内正确转录、翻译、表达，表达的蛋白位于胞质中，可与抗KGPed蛋白的抗体特异性结合。从而证实目的基因可在哺乳动物细胞中正确翻译并表达，为下一步利用pcDNA3 .1+/k群，cd作为基因疫苗免疫动物提供了依据。2.2 PcDNA3.l+l棍，cd免疫原性研究 以纯化的KGPed蛋白和PcDNA3.1+/k召夕cd经股四头肌注射、领下腺区皮下注射两种途径免疫BALB/c小鼠，然后收集唾液和血清样品，通过ELASA法检测各组唾液中slgA型及血清中IgG型抗KGPed抗体水平;并以免疫组化和间接免疫荧光观察重组蛋白KGPed在免疫部位的定位表达。方差分析显示:实验组唾液中slgA型及血清中IgG型抗体水平明显高于阴性对照组和空白对照组(p<0.01)，蛋白组抗体水平要高于重组质粒组(p<0.05)，而阴性对照组和空白对照组唾液中slgA型及血清中IgG型抗体水平均无显著性差异(p>0.01)。第5页第四军医大学博士学位论文一?