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烟草（Nicotiana tabacum L.）是重要的经济作物以及分子生物学研究中的模式植物,其叶面腺毛分泌物主要为类西柏烷、烷烃、蔗糖酯及醛、酮、酸等代谢物,这些物质跟烟草香气品质以及生物/非生物胁迫抗性密切相关。植物的表皮由扁平细胞、气孔及表皮毛组成,表皮毛根据其形态和分泌能力,分为非分泌型或分泌型表皮毛（腺毛）。烷烃的生物合成受到一系列转录因子和结构酶基因的控制,在模式植物拟南芥中,烷烃的合成属于蜡质/角质合成途径中的脱羰途径,且烷烃在拟南芥表皮毛中的合成具有特异性。然而,烟草中调控烷烃生物合成的相关转录因子及结构酶基因还未得到鉴定。本研究利用栽培烟草品种K326（N.tabacum L.cv K326）的腺毛及去腺毛叶片进行比较转录组测序,获得了与腺毛烷烃生物合成相关的R2R3-MYB型转录因子NtMYB306a,并对其功能进行了解析,此外,还鉴定到受NtMYB306a调控的烷烃合成关键酶基因NtCER1a,以及与NtMYB306a互作的NAC101、WD74等5个候选转录因子。研究为从分子水平揭示烟草腺毛烷烃的合成途径及调控机理提供了理论依据。主要研究结果如下:1.以烟草K326为材料,对叶片、去腺毛叶片、腺毛的总RNA进行转录组测序,获得97.2G原始数据。将差异基因筛选的阈值设定为:|log2foldchange|＞2且padj＜0.05,获得1512个在烟草腺毛中上调表达的基因,其中140个基因注释为转录因子;获得腺毛中上调表达的MYB转录因子21个,其中注释为MYB306的转录因子8个,将21个烟草MYB与拟南芥126个R2R3-MYB转录因子共同构建系统进化树,结果表明这8个MYB306为R2R3-MYB型转录因子S1亚组成员。2.从烟草腺毛的c DNA中克隆了NtMYB306a基因的全长CDS序列,长度为1065bp,编码354个氨基酸。氨基酸序列比对及进化树分析结果表明,NtMYB306a起源于其亲本绒毛状烟草。NtMYB306a具有典型的R2、R3结合结构域,属于R2R3-MYB转录因子S1亚组成员,而S1亚组成员通常与植物蜡质/角质合成相关,进而推测NtMYB306a具有相似的生物学功能;克隆了NtMYB306a基因的启动子p NtMYB306a,采用Plant CARE分析其顺式作用元件,发现p NtMYB306a含有SA、Me JA等多个激素及光、干旱等胁迫响应元件,以及跟表皮发育相关的L1-box元件,暗示NtMYB306a受到多种生物/非生物因素的调控并与表皮细胞发育或次生代谢相关。3.亚细胞定位及酵母反式激活实验表明,NtMYB306a定位于细胞核,是具有转录激活功能的转录因子。q RT-PCR实验结果表明,NtMYB306a在烟草茎、叶、花中表达,在腺毛中的表达量最高,m RNA原位杂交及GUS染色进一步确定了NtMYB306a在烟草腺毛中的优势表达,以上结果说明NtMYB306a在烟草腺毛中发挥着重要的生物学功能。此外,NtMYB306a的表达量受SA及低温胁迫诱导,进一步推测NtMYB306a与烟草防御有关。4.将NtMYB306a基因构建至植物表达载体并遗传转化K326,获得11株T0代过表达植株。对过表达株系OE-20 T1代和WT植株的叶片进行了RNA-seq测序,鉴定出700个在OE-20中上调表达的基因,角质、软木脂及蜡质合成的基因被KEGG显著富集,这与进化树所预测到的功能相一致,即NtMYB306a涉及烟草蜡质/角质的生物合成。采用q RT-PCR分析了OE-3、OE-13、OE-20 T2代株系中可能受NtMYB306a激活的靶基因,结果与转录组测序一致,NtMYB306a基因的过表达激活了烟草中一系列与烷烃合成或转运相关基因GDSL、ABCG32、KCS1、KCS3、KCS11、KCS20、CER1、CER3等的表达。5.采用GC-MS检测了NtMYB306a过表达植株的烷烃含量,结果表明过表达株系OE-3、OE-13、OE-20叶面分泌物中的总烷烃含量显著增加,其中n-C29、n-C31等正构烷烃,i-C31等异构烷烃、ai-C30等反异构烷烃的含量较WT明显增加。扫描电镜分析结果表明,NtMYB306a过表达植株的表皮细胞及腺毛的形态、数量较WT而言无显著差异。6.从烟草腺毛c DNA中克隆了烷烃合成途径的关键结构基因NtCER1a的全长CDS序列,长度为1869bp,编码622个氨基酸。生物信息学预测显示NtCER1a来源于其亲本林烟草,编码蛋白具有典型的蜡质合成相关FA＿hydroxylase（脂肪酸羟化酶区域）、Wax2＿C（蜡质碳端保守结构域）结构域以及2个跨膜结构,Cell-PLoc 2.0预测结果表明NtCER1a定位于内质网。克隆了NtCER1a基因的启动子并构建至酵母单杂诱饵载体p Ab Ai,Y1H Gold酵母单杂实验结果表明,NtMYB306a与NtCER1a基因启动子互作。以上结果初步说明NtCER1a属于CER1基因家族成员并参与烷烃的生物合成。7.采用Y2H Gold酵母双杂交筛库,从烟草腺毛c DNA文库中筛选与NtMYB306a互作的蛋白,共获得64个阳性克隆,经测序及Blast比对,结果表明筛选到5个转录因子,分别是VOZ1、NF-YA3、NAC101、WD74以及PAT1;此外,还筛选到一个与蜡合成或转录相关的GDSL脂肪酶编码基因。综上所述,我们根据烟草腺毛及去腺毛叶片的比较转录组测序,从烟草中克隆了R2R3-MYB型转录因子S1亚组成员NtMYB306a,NtMYB306a在烟草腺毛中优势表达并响应SA及低温胁迫的诱导。NtMYB306a过表达植株叶面分泌物-烷烃的含量显著增加,这是由于NtMYB306a能激活烷烃合成及转运途径相关基因GDSL、ABCG32、KCS1、CER1以及CER3等的表达,进而调控烷烃的生物合成。Y1H酵母单杂进一步验证了NtMYB306a与NtCER1a基因启动子互作,进而调控NtCER1a的表达;Y2H酵母双杂交筛库筛选到NAC101、WD74等5个与NtMYB306a互作的候选转录因子。论文的研究为探讨烟草腺毛烷烃生物合成的分子调控机制提供了有价值的理论基础。