SiRNA下调bFGF基因对肺腺癌A549影响的相关性研究

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目的与背景:肺癌是世界上最常见的癌症,肺癌可分为两大类:非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC),NSCLC (Non-small-cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌病例的80%~85%,非小细胞肺癌已成为全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。肺癌病死率无论男女均占恶性肿瘤病死率的第一位,严重威胁人类健康。近年来,随着分子生物学和药理学的不断发展,NSCLC的综合治疗及个体化治疗已取得明显进步,然而由于肿瘤耐药的出现,使得绝大部分肿瘤化疗后很快出现复发或转移,从而限制了许多化疗药物例如紫杉醇等抗肿瘤药物在NSCLC治疗的临床应用。bFGF在体内分布非常广泛,其生物学行为呈多样性和多效性分布。bFGF主要存在低亲和力受体和亲和力受体两类,分别为肝素受体和酪氨酸蛋白激酶受体;不同组织细胞FGF受体表达特异性。目前研究证实在肿瘤细胞的生长、生存、凋亡和在新生血管的FGFs-FGFRs信号通路的异常活化有关联并参与其过程。研究表明,肺癌患者血清bFGF含量和患者预后密切相关,血清含量高者预后较差。过往研究发现bFGF参与病理和生理的新生血管的机制相关[5],推测bFGF不仅在肺癌的发生、发展、浸润、转移过程中发挥着重要作用,还有机体的耐药性有关。构建靶向bFGF的siRNA,以脂质体为载体介导bFGF siRNA转染肺腺癌细胞株A549,利用实时荧光定量逆转录一聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reacti, RT-PCR)检测bFGF siRNA干扰下调前后细胞内bFGF的mRNA含量,筛选转染下调最显著的siRNA序列;利用蛋白质免疫印迹检测技术(western blot analysis, Western blot)检测bFGF siRNA干扰下调前后肺腺癌A549细胞内bFGF蛋白水平变化。应用MTT法即标准比色法检测bFGF siRNA干扰下调前后肿瘤细胞内bFGF的表达水平与紫杉醇药物敏感性的关系,为临床个体化治疗提供理论依据。方法:应用PUBMED查寻bFGF基因序列,NM002006.4,采用人工合成siRNA序列,同时以negative siRNA作为对照,能够用脂质体Lipofectamine2000为载体将bFGF siRNA导入肺腺癌A549细胞进行瞬时转染,对bFGF siRNA干扰下调前后肺腺癌A549细胞提取总RNA及总蛋白,应用RT-PCR技术对siRNA干扰下调前后肺腺癌A549细胞的bFGF mRNA进行定量分析,筛选出转染效率高的siRNA序列。再利用筛选的siRNA序列干扰下调肺腺癌A549细胞,步骤同前,Westen-blot法检测干扰下调后肺腺癌A549细胞中bFGF蛋白水平的表达。MTT比色法检测干扰下调前后肺腺癌A549细胞对紫杉醇药物敏感性的变化。应用流式细胞仪检测干扰下调后肺腺癌A549细胞凋亡和细胞周期的变化。结果:RT-PCR结果显示bFGF siRNA干扰下调后肺腺癌A549后bFGF基因水平表达降低,其中bFGF siRNA-2基因序列转染下调效率最高;Western blot检测结果显示siRNA-1干扰下调肺腺癌A549细胞后其bFGF蛋白表达水平较干扰下调前显著降低。MTT比色法检测干扰下调前后肺腺癌A549细胞对紫杉醇药物敏感性,结果显示干扰下调前后细胞对紫杉醇的抑制率较对照组显著增高(P<0.05)。流式细胞仪细胞凋亡检测显示:bFGF siRNA+紫杉醇组凋亡细胞比例较controlsiRNA组、control siRNA+紫杉醇组、bFGF siRNA组明显增加(P<0.05)。细胞周期检测显示control siRNA+紫杉醇组和bFGF siRNA+紫杉醇组G2/M期细胞百分率高于control siRNA组和bFGF siRNA组,差异有统计学意义(P<0.05)结论:干扰下调bFGF可以降低bFGF基因表达水平,增加了肺腺癌A549细胞对紫杉醇药物的敏感性,促进紫杉醇诱导的凋亡和抑制细胞生长。
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