【摘 要】
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采用基因工程技术提高漆酶产量和改善其酶学特性是降低漆酶使用成本和提高酶解效率的有效途径。论文以杂色云芝为出发菌株,克隆、表达和改造了漆酶基因,并建立了适宜的表达条件。主要研究结果如下：（1）通过RT-PCR克隆出两个漆酶基因lccl和lcc2。其中lccl基因全长1,497 bp,lcc2基因全长1,515 bp。lccl和lcc2氨基酸水平同源性为76.59%。（2）成功构建了漆酶毕赤酵母基因工
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采用基因工程技术提高漆酶产量和改善其酶学特性是降低漆酶使用成本和提高酶解效率的有效途径。论文以杂色云芝为出发菌株,克隆、表达和改造了漆酶基因,并建立了适宜的表达条件。主要研究结果如下：（1）通过RT-PCR克隆出两个漆酶基因lccl和lcc2。其中lccl基因全长1,497 bp,lcc2基因全长1,515 bp。lccl和lcc2氨基酸水平同源性为76.59%。（2）成功构建了漆酶毕赤酵母基因工程菌KM71H/lcc1和KM71H/lcc2。最高表达水平分别达到530 U/L、580 U/L。酶学性质研究表明,lccl最适温度为50℃,lcc2最适温度为60℃,二者在30℃、40℃、50℃时稳定性都较好；二者最适pH都为2.0,pH稳定性较好。（3）对重组酵母KM71H/lcc1在摇瓶中单因素诱导条件的研究结果表明,适宜的培养基初始pH为7.5,Cu2+浓度为0.5 mmol/L,甲醇添加量为1.0%,摇床转速为210r/min。同时,低温诱导及添加适量的蛋白胨和酪氨酸均有利于目的蛋白的分泌。采用响应面的方法对重组毕赤酵母产漆酶影响最大的3个因素进行优化,最佳组合条件为培养基初始pH7.0,甲醇添加量0.6%,Cu2+浓度0.5 mmol/L,优化后的酶活最高可达到2093U/L,为单因素优化的一倍。（4）以工业基础盐为培养基,控制温度为28℃、pH为6.0、溶氧为20%-40%,进行了高密度发酵,得到最高酶活为4100 U/L。（5）结合lcc2序列特点,定点突变了Asp208Asn,当以愈创木酚为底物时,突变后的最适pH变为5.0,向碱性方向偏移了0.5个单位；将lcc2双碱性氨基酸K196R197分别突变为R196K197和G196R197时,改造后的表达量并未提高,说明对lcc2而言,单独突变蛋白酶降解位点并不是提高酶活力的有效途径；优化了lcc2基因中五组连续稀有密码子,且漆酶的表达量与优化前相比有所提高；以酿酒酵母α因子信号肽和漆酶自身信号肽分别引导漆酶分泌表达时,酿酒酵母α因子信号肽作用效果比漆酶自身信号肽要好；成功地将SV40增强子添加到酿酒酵母α因子信号肽之前,但重组毕赤酵母并没有表达产漆酶。
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