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【目的】本研究拟以原核表达的GST-BoPrP(23～242)融合蛋白为抗原,免疫清洁级BALB/c小鼠,制备抗牦牛朊蛋白的特异性抗血清,验证GST-BoPrP(23～242)融合蛋白的反应性和免疫原性;以牛脑组织材料制成冰冻切片,以自制抗血清为一抗,对牛脑组织中分布的PrP进行检测,进而为疯牛病的检测和重组成熟BoPrP(23～242)单克隆抗体的制备提供技术方法和实验材料。 【方法】将保存的含有牦牛PrP基因重组表达菌提取质粒DNA,进行PCR扩增和双酶切鉴定,并在优化诱导表达条件(37℃,1mmol/L IPTG,6h)下,获得的表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测;将鉴定之后的重组表达菌诱导表达后,通过两种方法回收GST-BoPrP(23～242)融合蛋白:其一,是从包涵体中提取和复性GST-BoPrP(23～242)融合蛋白;其二,是通过SDS-PAGE直接分离并纯化GST-BoPrP(23～242)融合蛋白。回收的融合蛋白低温冻干保存。将回收的GST-BoPrP(23～242)融合蛋白作为抗原与弗氏佐剂以1:1的比例混合乳化后,按常规免疫方案分两组免疫8周龄的清洁级BALB/c小鼠,制备抗血清。用间接ELISA测定抗血清的特异性和效价。以自制抗血清为一抗,单抗4C11为对照,对牦牛重组成熟朊蛋白、GST蛋白、脑组织提取物和菌体蛋白进行Western blotting检测和间接ELISA试验,验证自制抗血清的特异性。以12健康头黄牛脑组织为研究对象,采取脑组织的不同部位制成冰冻切片,以自制抗血清为一抗和单抗4C11为参照,应用ABC染色法对蛋白酶K处理的和未作处理的切片染色,检测牛脑组织中朊蛋白的分布。 【结果】PCR扩增和双酶切鉴定发现,在琼脂糖凝胶中出现了一条与预期大小相符的约为660bp条带。表达产物的Western blotting检测发现,在NC膜上出现了一条分子质量大小约为50.2ku与单抗4C11发生反应的融合蛋白带;经Western blotting对自制抗血清特异性鉴定发现,NC膜上出现了一条与自制抗血清和单抗4C11发生反应的分子质量大小约为50.2ku的融合蛋白带,应用间接ELISA对自制抗血清特异性和效价测定表明,自制抗血清具有特异性,且其效价为1:12800。脑组织冰冻切片经ABC法染色后,400×镜下观察到:未经蛋白酶K处理的组织切片上出现了棕褐色颗粒,染色结果为阳性,经蛋白酶K处理的切片未出现棕褐色颗粒,染色结果为阴性,且染色效果与标准单抗4C11相同。