心肌缺血与多种心脏疾病的发展密切相关,是心肌梗死、恶性心律失常的急性诱因和加重因素,恢复对心脏缺血部位的血液供应是目前治疗缺血性心脏病的主要治疗措施,但血液再灌注会引起心肌缺血再灌注损伤(Myocardial Ischamia Reperfusion Injury,MIRI)这会导致患者病情恶化、影响患者预后,如何防治心肌缺血再灌注损伤一直是心血管医生面临的主要难题之一。MIRI的发病机制错综复杂,氧自由基增加、心肌能量代谢障碍及钙超载等与MIRI的发生发展均密切相关且相为作用,最终加重心肌细胞的损伤,导致坏死和凋亡。氧自由基增加会导致线粒体功能障碍,其凋亡信号转导通路被激活,最终导致细胞凋亡。抑制氧自由基增加,激活抑制细胞凋亡的相关通路也是目前研究的热点。已有的研究证实大车前苷具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用,本课题组前期研究进一步证实了大车前苷(Plantamajoside,PMS)还具有抗心肌细胞肥大的作用,但大车前苷在心肌缺血再灌注损伤方面的机制研究目前鲜有报道,故本实验建立体外H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤模型,模拟在体心肌缺血再灌注损伤,探究大车前苷对MIRI的保护作用及可能的机制。同时,有研究揭示ILK/Akt/c-Src信号通路的激活与MIRI的病理生理过程亦紧密相关,ILK过表达能够减少再灌注损伤过程中的心肌细胞凋亡数量。本研究探索了该通路在大车前苷抑制心肌缺血再灌注可能起到的作用,并对相关机制进行了初步阐明。目的研究大车前苷对H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的影响,探讨其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用和可能的作用通路。方法(1)MTT试验测定缺氧复氧损伤对H9c2心肌细胞存活率的影响,建立H9c2细胞缺氧复氧损伤模型;(2)采用MTT试验测定不同浓度(5-120μM)的PMS对H9c2心肌细胞存活率的影响;(3)通过乳酸脱氢酶释放量试验、Hoechst33342荧光染色试验、丙二醛释放量试验、超氧化物歧化酶活力测试以及ROS释放量试验对大车前苷进行活性验证;(4)Annexin V/PI双染测定大车前苷抑制H9c2细胞凋亡的作用;(5)对H9c2细胞内线粒体凋亡信号通路及ILK/Akt/c-Src信号通路的蛋白表达产物进行测定;(6)采用RT-PCR法测定H9c2细胞内线粒体凋亡通路及ILK/Akt/c-Src信号通路基因表达产物。结果(1)缺氧7小时复氧6小时可显著降低H9c2细胞存活率至50%左右;(2)在5-40μM浓度范围内的大车前苷无细胞毒性,大车前苷(10,20,40μM)可提高缺氧复氧诱导的细胞存活率,呈浓度依赖性且单独处理细胞不影响其增殖生长;(3)与缺氧复氧损伤(H/R)组相比,不同浓度(10,20,40μM)的大车前苷可显著降低LDH、MDA及ROS释放量,提高SOD酶的活力,并且呈浓度依赖性;(4)与H/R组相比,不同浓度(10,20,40μM)的大车前苷可显著减少细胞凋亡,呈浓度依赖性;(5)大车前苷促进ILK、p-Akt、Bcl-2蛋白的表达,降低Bax、Caspase-3、p-c-Src、Cytochrome c蛋白表达,呈浓度依赖性。(6)大车前苷促进ILK、Bcl-2基因的表达,降低Bax、caspase-3、Cytochrome c基因表达,呈浓度依赖性。结论大车前苷对H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤具有保护作用,其保护作用机制可能与ROS清除、抑制线粒体凋亡途径、激活ILK/Akt/c-Src信号通路有关。