登革热(dengue)是全球蔓延最快的虫媒传播疾病,通过感染登革病毒(DENV)蚊子的叮咬在人群中传播,全世界40%以上约25亿人面临罹患登革热危险。感染4种DENV (DENV-1,DENV-2,DENV-3和DENV-4)血清型的其中一种都会引起广泛的临床症状,从轻微症状或典型登革热,类似于流感样症状,剧烈头痛和关节肌肉痛；到小部分患者出现威胁生命的重症登革热,曾称为登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)或登革休克综合征(dengue shock Syndrome, DSS)。登革热的传播常发生在全球热带和亚热带气候的城市和城郊地区,已成为一个主要国际公共卫生的重要问题。近些年来,东南亚和美洲地区的登革热疫情日趋严重,几乎每年都会在中国的广东、广西、海南和福建出现不同程度的流行,其中,广东地区是高发地区。截止2014年,四种血清型的DENV均在我国发生过流行,但是以DENV-1较为常见。2014年6月广州地区爆发近二十年最大规模的登革热。世界卫生组织于2014年强调,目前登革热没有有效的治疗手段和疫苗,只能够通过减少及控制传播媒介蚊子的传播、避免遭受叮咬的个人防护措施预防登革热的传播和发展。因此,本研究的意义在于能够对疫苗候选及其安全性评估有所帮助。DENV基因组是单股RNA链(大约1lkb),包含单个开放读码框,编码三个结构蛋白和七个非结构蛋白。三个结构蛋白包括衣壳蛋白(capsid, C)、前膜/膜蛋白(premembrane/membrane, prM/M)和包膜蛋白(envelope, E);七个非结构蛋白(nonstructural protein, NS)包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、 NS4B和NS5。多聚蛋白的合成在细胞质粗面内质网上完成。E糖蛋白是成熟病毒颗粒主要外露蛋白,以头尾相连的90个E蛋白二聚体平铺于病毒颗粒表面脂质双分子层中。外功能区划分为三个结构域和功能域：EDⅠ, EDⅡ, EDⅢ。E蛋白与病毒附着,融合,细胞趋向以及保护性免疫应答的诱导产生有关联。黄病毒属病毒代表致病性基因标志大部分位于E蛋白基因。其中,EDⅢ包含免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)样域,形成7股Ig样折叠,介导病毒与附着宿主细胞膜结构之间的相互作用,是中和抗体识别的关键表位。DENVE蛋白氨基酸序列同源性高,且是保守的。每种血清型的E蛋白氨基酸序列最小相似性为90%～96%,血清型间E蛋白氨基酸序列相似性一般为60～70%。针对DENV EDⅢ蛋白以及其相应抗体功能研究一直是登革热研究热点,大量关于EDⅢ及其抗体的动物性实验研究表明针对四种血清型强烈的中和保护性的EDⅢ抗体,其识别表位主要位于EDⅢ的侧脊和A链区。然而,近些年有研究表明,存在于DENV感染人血清中EDⅢ抗体的中和保护性和增强感染的作用是微弱的,亦有研究表明DENV感染人血清和鼠EDⅢ抗体所识别的表位是相似的。非结构蛋白NS1以多聚体的形式分布于细胞不同区域,可以分为膜型和分泌型两种形式,分泌到细胞外的NS1以六聚体形式存在。NS1蛋白参与感染细胞转运和病毒复制。NS1蛋白能够作为一个重要的早期诊断的生物标志物,研究表明DENV感染患者在感染早期阶段的高浓度。NS1蛋白与后继严重疾病的发生相关联,检测的NS1蛋白量越高其相应疾病越严重。使用DENV NS1抗原捕获ELISA法检测DENV感染患者血清显示,感染DENV早期患者NS1蛋白分泌量可高达50ug/ml。因此本研究将其作为评价感染程度的评估指标。目前疫苗研究的难点在于,感染一种DENV血清型并恢复后,机体诱导产生的高效价中和抗体,只对同型病毒具有终生免疫,但对此后感染的其他三种血清型病毒只有部分和短暂的交叉免疫。随后感染其它血清型病毒会增加罹患重症登革热的危险。重症表现常见于二次异型DENV感染的患者,尽管少数初次DENV感染的患者也会出现。当二次DENV感染时,先前存在的非中和或亚中和抗体与病毒表面抗原结合,促进病毒-抗体复合体进入FcyR细胞及细胞内摄取,进而导致大量病毒复制和严重病理变化,这种现象称之为抗体依赖性增强(antibody-dependentenhancement, ADE)。正是由于四种DENV血清型感染导致ADE现象的出现,严重阻碍了登革疫苗的研发。理想的DENV疫苗必须对四种DENV血清型均具有保护作用；能够提供终身保护作用；无明显的局部和全身性不良反应；对登革热疫区的全部人口具有普遍的有效性且成本低廉。因此,本研究旨在有助于评估疫苗的增强感染的研究。基于以上研究背景,我们推测,在自然状态下,DENV感染机体后,登革病毒的多种抗原成分均能够诱导机体产生适应性免疫应答,各种抗原成分在抗原竞争中,形成了优势表位与非优势表位,但是后者在抗原竞争中难以有效地刺激中和保护性。因此,我们探索非优势抗原表位是否能够作为单一的免疫原,刺激机体产生强烈中和保护性且微弱或无增强感染的抗体。本研究集中在以下三个方面：一、DENV EDⅢ交叉反应单抗识别表位的关键残基的确定本团队前期工作中分别使用四种DENV血清型重组EDⅢ蛋白免疫小鼠,制备了一组抗DENV-1,-2,-3和-4 EDⅢ的单抗,筛选出对四种血清型DENV有交叉反应性的单抗。对这些单抗进行合成重叠多肽扫描分析中发现,大约2/3的交叉反应性单抗特异性识别高度保守的EDⅢ aa310KEVAETQHGT319序列,并且鉴定了这些单抗与重组EDⅢ蛋白结合能力强但中和活性较为复杂,表现为对四种不同血清型DENV出现强烈、中等或无的中和活性。为了进一步明确该氨基酸序列中抗原抗体结合的关键残基,我们采用酵母表面展示技术将DENV EDⅢ蛋白表达在酵母细胞表面,并使用定点突变技术对aa310-319的十个氨基酸进行逐一突变,随后将突变质粒转入酵母细胞,获得十种EDⅢ单点突变蛋白。使用流式细胞分析EDⅢ交叉反应单抗与十种突变体的结合情况。酵母表面展示技术是研究可溶性蛋白间相互作用的有效工具,其可以简单快速地用于确定抗原与抗体、受体与配基的结合及相互作用。酵母以其真核细胞翻译后蛋白加工修饰的特点,使其表达产物更接近于天然构象。体外定点突变则是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系常规工具,能够简便、快速且高效的获得改造DNA序列或DNA表达的目的蛋白,从微观水平上阐明正常状态与突变状态的差异性。酵母展示技术与定点突变技术联合运用,简便高效的实现突变DNA序列在蛋白表现情况。研究结果发现,EDⅢ氨基酸序列中的Q316和H317是交叉反应EDⅢ单克隆抗体抗原抗体结合的关键残基,为进一步优化修饰EDⅢ亚单位疫苗的策略奠定基础。二、建立高通量简便的方法评价DENV抗体的增强功能DENV诱导机体产生的抗体反应是一把双刃剑,有保护性免疫,也可能加重病情。所以,DENV抗体的研究必须从保护性能和增强感染性能这两方面着手。DENVE蛋白是主要的保护性抗原,也是中和抗体主要的靶向成份。当具有中和活性的抗体分子与E蛋白抗原决定簇结合,阻止E蛋白与靶细胞结合或者阻止病毒RNA释放进入易感细胞的细胞质中,即发挥保护作用。而当亚中和或非中和抗体Fc段与细胞膜上Fcy受体(FcyR)结合,增加了DENV和细胞黏附的机会,从而促使DENV进入细胞,使得细胞易感。基于感染DENV后NS1蛋白分泌与登革热疾病的严重程度是密切相关,本团队前期建立了测定抗体和血清中和活性的酶联免疫斑点微中和实验(enzyme-linked immunospot microneutralization test, ELISPOT-MNT)方法,能够方便、客观地评价DENV抗体的中和活性。因此,为了更全面评价抗体或血清中和保护性和增强活性,我们建立并评估ADE技术是在前期建立的NS1抗原捕获ELISA检测DENVNS1蛋白含量的基础上,用表达FcyR的K562细胞株和已知公认的具有增强活性的单抗4G2为阳性对照,建立了高通量简便的检测登革抗体和血清的ADE检测方法(ADE assay based quantitative measurement of NS1 antigen capture ELISA, ELISA-ADE)。即使用传统病毒滴度测定方法平行验证NS1抗原定量新ELISA-ADE方法检测4G2增强感染时的NS1蛋白含量是否具有一致性,经过Spearman相关分析表明,两种方法显著相关。随后,使用ELISPOT-MNT和ELISA-ADE方法检测了4G2和6份DENV-1感染患者恢复期血清的中和活性和增强活性,发现4G2和患者血清的增强峰值均出现在亚中和浓度,符合公认的中和与增强浓度关系,进一步验证ELISA-ADE方法学的可靠性。并且分析了前期制备具有强烈中和活性的交叉反应EDⅢ单克隆抗体2D73和3E31的中和活性与增强活性的关系。结果显示,2D73的ADE增强感染峰值同样出现在亚中和浓度下,而3E31仅有微弱或无增强感染的效应。提示3E31具有作为免疫治疗性抗体的潜能。三、 DENV-1感染患者血清和兔抗EDⅢ血清的EDⅢ反应抗体的功能研究DENV EDⅢ是中和抗体的靶标,是有潜力的登革疫苗的候选者。然而,近些年研究表明DENV感染人血清中的EDⅢ抗体仅占DENV总抗体的一小部分,其中和活性和增强活性作用微弱。但我们分析认为：在DENV自然感染中,多种DENV抗原可诱导产生多克隆多特异性抗体,有些诱导保护性反应的表位未必是优势表位,因而在抗原竞争中处于弱势而不能产生足量的保护性抗体。针对这种情况可利用纯化的亚单位疫苗来避免抗原竞争而诱导有效的保护性反应。国外多数DENV感染患者血清的EDⅢ抗体的研究集中在DENV-2和-3感染,而中国南方地区60%的DENV感染为DENV-1。本研究用重组DENV-1EDⅢ免疫新西兰白兔制备抗EDⅢ多克隆免疫兔血清,全面分析了抗EDⅢ兔血清与DENV-1感染患者恢复期血清中EDⅢ反应抗体的中和保护作用与ADE效应,探索EDⅢ作为亚单位疫苗候选抗原的可能性。我们分析了30份DENV-1感染患者恢复期血清的中和活性与EDⅢ结合抗体滴度的关系,使用Spearman相关性分析,结果显示患者血清与EDⅢ蛋白结合的抗体滴度远低于中和滴度,且两者不相关；说明EDⅢ抗体与DENV感染的中和保护性没有关联。进一步从30份患者血清中,随机挑选6份去除患者血清中EDⅢ反应抗体,结果发现去除EDⅢ抗体前后,患者血清对同型和异型DENV的中和活性与增强活性均没有变化。说明DENV感染患者血清中EDⅢ抗体作用微弱,与其他研究团队结果相一致。兔抗DENV-1 EDⅢ血清对同型DENV的中和活性为较高稀释度1：50,000,增强活性较低为1：5,000；值得注意的是,兔抗EDⅢ血清对异型DENV感染的增强峰值仅为1：40,这提示EDⅢ免疫原免疫兔子,体内产生的EDⅢ反应抗体在二次异型感染中是安全的。去除兔抗EDⅢ血清的EDⅢ反应抗体后,中和活性与增强活性全部消失。这说明虽然DENV EDⅢ不是登革病毒自然感染过程中的主要抗原,但是纯化或重组的DENV EDⅢ仍然能够作为亚单位疫苗,刺激有效安全的免疫应答反应。小结本课题使用酵母表面展示蛋白技术和定点突变技术,获得EDⅢ交叉反应性抗体特异性识别高度保守的aa310-319序列的关键残基,位于EDⅢ蛋白AB环的Q316和H317。为了全面评估DENV抗体和血清的增强感染的性能,首次建立基于NS1蛋白捕获ELISA的ADE检测(ELISA-ADE)方法,在96孔板上实施高通量简便的检测,与前期建立的检测中和性能ELISPOT-MNT方法学联合运用,全面评价DENV抗体和血清的增强和中和保护性能。这进一步为探索免疫治疗性抗体,以及评估DENV疫苗的安全性和有效性提供有效的、高通量、简便的技术手段。在前期建立稳定方法学的基础上,使用重组DENVEDⅢ蛋白免疫家兔,获得抗EDⅢ的兔多克隆抗体血清,证实抗DENV-1 EDⅢ兔血清中的EDⅢ反应抗体在中和活性和增强活性中起关键作用,并且抗EDⅢ兔血清对二次异型DENV感染是安全的。同时印证了DENV-1感染患者恢复期血清中EDⅢ抗体的中和与增强功能甚微。这提示虽然DENV EDⅢ在登革病毒自然感染过程中的不是关键保护与增强作用的免疫原,但是纯化或重组的DENY EDⅢ仍然能够作为有潜力的亚单位疫苗,刺激有效安全的免疫应答反应。