阿尔茨海默病(AD)是危害老年人健康的最常见痴呆。临床治疗现仍以乙酰胆碱酯酶抑制剂为主，疗效不够理想。Aβ是AD的致病元凶，其异常沉积是AD的病理学特征。近来学界认为，体内Aβ失衡，也即Aβ过度生成或降解清除障碍是致其过度沉积的根本原因。针对Aβ，减少产生、促进降解、抑制聚集、加速清除是未来AD治疗的主要方向。胰岛素降解酶(IDE)作为重要的Aβ降解酶近年备受关注，对其表达或活性的调节将会是未来AD治疗的新思路。2004年，Zhao 等通过一系列体内外实验发现：IDE可能是胰岛素信号通路下游的一个调节靶位，增强该通路可以上调IDE。而大量证据也提示，胰岛素抵抗或胰岛素信号转导障碍随着衰老的过程不断进展，并参与了AD的发病。因此我们推论：增强胰岛素信号通路，将不仅能纠正潜在的增龄相关胰岛素抵抗，更可能通过增加IDE表达而加速Aβ降解，对AD发挥治疗作用。 为验证这一假设，本研究选用PPARγ激动剂这一胰岛素增敏剂来增强胰岛素信号通路，分别从体内、外水平探讨通过增强胰岛素信号通路、上调IDE进而促进Aβ降解的可能性。 第一部分 PPARγ激动剂上调原代培养海马神经元TDE表达 目的 观察体外水平上，PPARγ激动剂对IDE表达的影响，并与胰岛素进行比较；选择有效上调IDE的最佳干预剂及最适干预条件。 材料与方法 原代培养海马神经元，接种后7-10天，以MAP-2免疫荧光染色鉴定纯度。分别以胰岛素 2、20、200 nmol/L，吡格列酮 0.01、0.1、1 μmol/L，罗格列酮 0.01、0.1、1 μmol/L，及PBS 0.01mol/L处理6、12、24小时等不同的时间。以MTT比色法观察细胞生存率，RT-PCR检测IDE mRNA表达，Western blot检测IDE蛋白水平的变化。 结果经鉴定，原代海马神经元纯度在95％以上。各不同浓度、时间、干预剂的处理均未降低细胞生存率。与PBS组相比，各浓度的胰岛素(INS)、吡格列酮(PGZ)、罗格列酮(RSG)干预均能不同程度地上调IDE mRNA表达，作用效应呈剂量依赖性：处理6h，IDE mRNA表达的变化并不明显；至12h，IDE mRNA表达明显增高，高剂量组的增高程度更为突出；至24h，剂量依赖性表达上调趋势进一步体现，其中以RSG 1 μmol/L的上调作用最为显著。IDE蛋白表达的变化也有类似趋势：处理6h，IDE轻度上调，RSG 1 μM组最为显著；至12h，IDE显著上调，仍呈剂量依赖性；至24h，亦基本延续了上述作用趋势，但IDE蛋白表达并无更为显著地上调。各干预条件中，RSGl μM上调IDE的效应最为显著。本部分结果提示，INS、PGZ、RSG均能上调IDE表达，无论从mRNA水平和蛋白水平均是如此。后两者的上调效应与INS相当，甚至强于INS。同时，各组对IDE的表达上调均呈剂量依赖性，以RSG 1 μM作用最强。表达上调从干预6h开始，12h即已充分显现。因此，选择RSG 1 μM处理12h作为后续实验的干预条件。 第二部分罗格列酮对Aβ损伤的神经保护及与IDE的关联 目的 考察RSG对体外培养神经元Aβ毒性的保护；初步探讨该神经保护效应的作用途径。 材料与方法 原代海马神经元接种7-10天，分别接受如下处理：Aβ40 5μM，Aβ40 5μM+RSG 1μM，A β42 1μM，Aβ 42 1μM+RSGlμM，Aβ42 1μM +RSG1μM + Wortmannin 50nM，Aβ42 1μM+RSG1μM+1，10-phenanthrolinel0μM。处理12h后，观察细胞形态学变化，以Hoechst33258染色、流式细胞计数检测凋亡，MTT比色法检测细胞生存率，Western-blot 测定 IDE，pAKT/tAKT，pGSK3β/tGSK3 β蛋白表达，ELISA测细胞培养上清液中A β 40、A β 42含量。 结果 Hoechst33258 染色结果显示，A β 40、A β42 处理后凋亡细胞增多，而RSG 使凋亡比例显著下降31.91％和30.79％(p<0.05)。流式细胞计数示，RSG使A β40、A β42处理后凋亡细胞分别减少39.15％和50.48％；使坏死细胞分别减少35.29％和20.30％(p<0.05)。MTT比色示，RSG使A β40、A β42处理后细胞生存率增加32.89％和43.91％(p<0.05)。RSG还可将Aβ40、42组的IDE蛋白分别上调168％(p<0.05)和150％(p<0.05)；将pAKT/tAKT比例上调123.33％(p<0.01)和150％(p<0.01)，将pGSK3 β/tGSK3 β比例上调66.67％(p<0.05)和45.83％(p<0.05)。此外，RSG能使培养上清液中A β 40从4.56μM减少到3.65μM(p<0.05)，使Aβ42从0.90μM减少到0.67μM(p<0.05)。加入P13K抑制剂Wortmannin以后，RSG对A β 42组IDE、pAKT蛋白水平的上调作用明显减弱，分别降低50％、57％(p<0.01)，凋亡细胞显著增多，从22.03％增至42.15％，上升91.33％(p<0.01)。加入IDE阻断剂1，10-phenanthroline后，RSG对IDE及pAKT表达上调作用仍保持不变(p>0.05)，但凋亡细胞仍有所升高，增加57.92％ (p<0.05)。本部分结果提示RSG对Aβ40、Aβ42的神经毒性均有保护作用，主要通过增强胰岛素信号通路、上调IDE表达、促进Aβ降解来完成。 第三部分罗格列酮对增龄相关IDE下调及AD样模型大鼠的作用 目的 观察增龄相关的IDE表达、活性及胰岛素信号通路的变化，了解RSG可能的纠正作用；观察RSG对Aβ制模AD样大鼠的作用。 材料与方法 健康雄性SD大鼠，根据不同月龄和处理分为以下6组：3月龄，12月龄，18月龄，18月龄+RSG，18月龄+Aβ42，18月龄+Aβ42+RSG。青年大鼠(4m) 每组8只，老年大鼠(12、18m)每组12只。RSG，1mg/kg/天，每日晨单次灌胃，连续给药4个月。造模组双侧海马CA3区立体定向注射Aβ42 10<-4>M 5μ1。观察各组大鼠的一般情况，以Morris水迷宫评定大鼠认知行为，Western-blot及免疫荧光染色检测IDE、pAKT的表达，放射免疫法测定IDE活性，以ELISA测定脑内Aβ水平。 结果 伴随衰老的进展，大鼠认知功能进行性下降。Morris水迷宫测试3月龄组最佳(平均逃避潜伏期9.70s，18月龄组最差(27.80s)，12月龄组介于二者之间(15.50s)，RSG干预的18月龄大鼠认知有所改善(14.60s)(p<0.05)。空间搜索试验：与3月龄相比，12月龄的大鼠穿越平台次数下降22.22％，p<0.05；18月龄组下降27.78％(p<0.01)；给予RSG后，穿越平台次数较18m增加23.08％(p<0.05)。同时，IDE及pAKT表达随月龄增长亦进行性减少。3m与12m两组差异显著，p<0.05，与18m间差异进一步扩大，p<0.01。18m大鼠给予RSG4个月后，pAKT表达上调，IDE表达也相应提高(与18m未服药组相比，p<0.05)。IDE、pAKT免疫荧光染色也有类似改变(p<0.05)。IDE活性亦呈增龄相关，12m即已显著下降至较低水平(p<0.01)。18m大鼠给予RSG干预能中等程度地上调肝脏IDE活性(p<0.05)，轻度上调脑组织IDE活性。RSG使Aβ42制模AD样大鼠的认知损害部分减轻，逃避潜伏期由79.40s减至58.51s，降低26.31％，p<0.05。Aβ42+RSG干预组的脑内Aβ水平较低，从235.53pM降至187.34 pM，降低20.46％，p<0.05。 本部分研究提示，正常衰老的大鼠存在增龄相关的胰岛素信号通路减弱、IDE下调及认知功能减退，随衰老进展进行性加重。RSG能改善增龄相关胰岛素信号通路障碍并在一定程度上逆转IDE的表达和活性减低。在Aβ42制模AD样大鼠中，RSG亦能减低脑内Aβ42水平，改善认知。 1、以罗格列酮为代表的PPAR γ激动剂能在体内、外有效上调IDE表达及活性，促进Aβ降解，发挥神经保护作用。 2、这种神经保护作用主要通过增强胰岛素信号通路、上调IDE而完成。 3、正常衰老过程中存在增龄依赖的胰岛素信号通路障碍和IDE下调，这可能导致认知水平下降并参与了AD的发病。RSG可通过纠正胰岛素信号通路障碍、上调IDE发挥治疗作用。