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目的：本研究重点探讨左归丸促进衰老大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)增殖的调控机制。根据“肾精亏虚致衰老理论”和“干细胞具有先天之精属性,是先天之精在细胞层次的存在形式”理论假说,在前期左归丸对衰老大鼠骨髓MSC增殖效应的基础之上,进一步探讨左归丸促进衰老大鼠骨髓MSC增殖的分子调控机制。为“精”的干细胞学说提供更充分的科学依据,也为中医药干预干细胞移植治疗难治性疾病提供有力的实验依据。方法：一、骨髓MSC分离、培养、纯化和鉴定全骨髓贴壁法分离、培养MSC,通过形态学观察和免疫荧光技术检测细胞表面标志物鉴定骨髓MSC。二、左归丸调控衰老大鼠骨髓MSC增殖的机制(一)经腹腔注射一定浓度D-半乳糖建立亚急性衰老大鼠模型。治疗选用补肾益精经方左归丸水煎剂灌胃。(二)细胞培养到P3代,RT-PCR检测细胞因子BMP-2、G-CSF、GM-CSF、IL-6、IL-7、 LIF、OSF、SCF、SDF-1、p21、p16、p53、c-Myc mRNA的表达；Real-time PCR进一步检测差异基因的表达水平。Western blot检测差异基因的蛋白表达水平。(三)基因芯片技术筛选Wnt/β-Catenin信号通路中差异表达的基因,Western blot检测差异基因的蛋白表达水平。三、左归丸对体外诱导的衰老骨髓MSC增殖效应和机制的初步研究(一)运用全骨髓贴壁法分离、培养骨髓MSC。细胞培养至P3代,加入D-半乳糖诱导细胞衰老。左归丸组给予含一定浓度左归丸水煎剂的培养液进行干预培养。(二)细胞姬姆萨染色观察细胞的形态；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色评价细胞衰老阳性率；MTT法、流式细胞周期术检测比较各组细胞的增殖能力。(三) RT-PCR检测各细胞因子BMP-2、G-CSF、GM-CSF、IL-6、IL-7、LIF、OSF、SCF、 SDF-1、p21、p16、p53、c-Myc mRNA表达。Real-time PCR进一步检测差异基因的表达水平。结果：一、骨髓MSC分离、培养、纯化和鉴定免疫荧光染色法检测大鼠MSC表面标志抗原,CD44表达为阳性,CD45表达为阴性。二、左归丸调控衰老大鼠骨髓MSC增殖的机制(一)各组P3代细胞形态：正常组细胞生长良好,细胞呈梭形漩涡状生长,胞核呈规则圆形；模型组细胞生长缓慢,细胞较大,胞核不规则,胞质可见颗粒状物质,并见不同程度的细胞膜破裂；中剂量组细胞生长较好,胞核大部分呈规则分布,胞核可见少量颗粒状物质,未见明显细胞膜破裂。(二)Real-time PCR检测：衰老大鼠骨髓MSC SCFmRNA表达水平显著低于正常组和中剂量组(P<0.05),p21mRNA表达显著高于正常组和中剂量组(P<0.05)。(三)Western blot检测：模型组SCF蛋白表达量显著低于正常组(P<0.01)、p21蛋白表达量显著高于正常组(P<0.01)；中剂量组SCF蛋白表达量显著高于模型组(P<0.05)、p21蛋白表达量显著低于模型组(P<0.05)。(四)在Wnt/β-Catenin信号通路89个相关基因中：与正常组比较,模型组表达上调基因有Kremen1、Kremen2、Wnt4等,表达下调基因有Wnt2、Wnt3a、Wnt7a等。与模型组比较,中剂量组上调基因有Wnt2、Wnt3a、Jun等,表达下调基因有Kremen2. sFRP5.Wnt9b等。(五)Western blot检测Wnt/β-Catenin信号通路差异基因的蛋白表达水平：模型组细胞Wnt3a表达量显著低于正常组(P<0.01)、Kremen2蛋白表达量显著高于正常组(P<0.01)；左归丸组细胞Wnt3a蛋白表达显著高于模型组(P<0.05)、Kremen2蛋白表达量显著低于模型组(P<0.05)。三、左归丸对体外衰老骨髓MSC增殖效应和机制的初步研究(一)姬姆萨染色：模型组P3代骨髓MSC呈现衰老细胞形态学特征,左归丸干预治疗后,各组大鼠骨髓MSC的细胞形态与正常组相近。(二)细胞衰老β-半乳糖苷酶染色：模型组骨髓MSC细胞衰老染色阳性率显著高于正常组和左归丸组(P<0.01)。(三)MTT结果显示：模型组骨髓MSC增殖能力显著低于正常组和左归丸组(P<0.01)。(四)细胞周期检测：模型组的细胞多数停滞在DNA复制前期(G1期)(P<0.01)；左归丸干预治疗后,停滞在G1期的细胞数量显著减少(P<0.01),多数细胞快速进入DNA复制期。(五)Real-time PCR结果：模型组SCFmRNA表达水平显著低于正常组和中剂量组(P<0.05)；模型组p21mRNA表达水平显著高正常组和中剂量组(P<0.05)。结论：一、采用全骨髓贴壁法可获得稳定、均质性良好的大鼠骨髓MSC。二、左归丸具有显著的延缓干细胞衰老作用,可通过抑制Kremen2和促进Wnt3a途径激活Wnt/β-Catenin信号通路,并促进SCF表达,抑制p21表达,调节细胞周期,从而促进衰老大鼠MSC增殖。三、左归丸水煎液可促进MSC体外衰老模型的增殖能力,其机制可能与p21和SCF表达有关。四、本研究进一步从分子和蛋白水平证明了“干细胞具有先天之精属性,是先天之精在细胞层次的存在形式”理论假说的的科学性,丰富“肾藏精”现代理论新实质。