【摘 要】
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皖东牛和大别山牛是安徽省两个重要的地方品种资源,是人们在不同环境下经长期培育形成的,其体型、适应性和生产性能差异明显,是我国肉牛遗传育种的重要素材。本研究分别采集了20头大别山牛和34头皖东牛成年母牛（每头动物均来自不同谱系,年龄24月龄以上）血样,分别进行转录组测序（7头大别山牛和8头皖东牛）、荧光定量PCR实验（7头大别山牛和16头皖东牛）以及焦磷酸测序实验（6头大别山牛和10头皖东牛）。通过
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皖东牛和大别山牛是安徽省两个重要的地方品种资源,是人们在不同环境下经长期培育形成的,其体型、适应性和生产性能差异明显,是我国肉牛遗传育种的重要素材。本研究分别采集了20头大别山牛和34头皖东牛成年母牛（每头动物均来自不同谱系,年龄24月龄以上）血样,分别进行转录组测序（7头大别山牛和8头皖东牛）、荧光定量PCR实验（7头大别山牛和16头皖东牛）以及焦磷酸测序实验（6头大别山牛和10头皖东牛）。通过对转录组测序数据的深入研究,获得两种牛的基因表达水平和位点变异信息,结合相关验证试验及统计分析,以解析皖东牛和大别山牛的系统分类地位、鉴定种质差异基因以及性状相关基因。首先,依照GATK最佳实践分析流程,采用STAR二次比对方法分析转录组测序数据,检测和解析了基因组单核苷酸多态性位点、小片段插入及缺失位点。从公共数据库获取4头秦川牛转录组测序数据,8头伊朗当地牛和25头乌干达本地牛的全基因组测序数据,开展了牛品种系统演化分析。其次,将转录组测序数据与基因组进行比对,用RSEM程序计算基因的表达水平,分析两种牛之间的基因表达差异;使用KNN算法填补缺失值,并根据测量到的性状信息,统计基因表达水平与性状是否存在线性相关性;进一步通过荧光定量PCR实验验证。最后,通过变异位点的全基因组关联分析,以及基因水平的全基因组关联分析寻找两种牛的差异基因,并通过焦磷酸测序实验验证。主要研究结果如下。1.转录组测序及公共数据共获取52头普通牛,共有425728个双等位基因。主成分分析（PCA）表明,中国的皖东牛、大别山牛和秦川牛与非洲牛和中东牛被PC2分隔成不同种群类别,相互距离与这些品种的实际地理距离相似;皖东牛和大别山牛形成了一个明显的牛群分支。2.有效种群大小研究表明,大约从6000年前至约78年前,大别山牛与皖东牛有效种群大小在逐渐减小,而Tajima’s D检测结果预示两种牛有效种群大小未来有进一步减小的趋势。3.通过对TPM值的比较,在两个品种之间鉴定出113个差异表达基因,其中64个基因在大别山牛的表达量显著高于皖东牛,另外21个基因表达量显著低于皖东牛。此外,回归分析发现5个基因表达水平与体尺性状显著相关。通过独立样本的荧光定量PCR实验,鉴定出ANXA1、ETS1和KLF2基因表达水平与品种差异相关,PSPC1基因表达水平与体长相关。4.对转录组测序数据采用二次比对方法,在皖东牛大别山牛中共检测到724998个单核苷酸多态性（SNPs）位点和44883个小插入和缺失（In Dels）位点,经编码变异的基因水平关联分析发现,30个基因在两种牛之间存在显著性差异（P＜0.05）。针对差异最显著基因:免疫调节因子CD48（P=1.3E-6）,凝血因子受体F2R（8.83E-05）以及脯氨酰羧肽酶PRCP（6.47E-05）,重新采集了6头大别山牛,10头皖东牛的焦磷酸测序验证实验。结果显示转录组测序发现的27个功能性变异位点有26个被检测到相应变异,检出率为96.3%,卡方检验与原转录组测序一致,并且CD48基因和PRCP基因变异与品种显著相关（P＜1.67E-2）。系统性荟萃分析发现PRCP基因在两组独立样本独立平台的实验结果之间没有异质性,鉴定为两种牛之间的遗传差异基因。5.编码变异的单倍型分析发现,PRCP基因8个功能性变异位点共含有5种单倍型。其中皖东牛单倍型c.GAAGACCA/p.CIANPT频率0.62,显著高于大别山牛（P=2.8E-3）,大别山牛单倍型c.TCGAGGCC/p.FLTSRTQ频率为0.54,显著高于皖东牛（P=0.03）。蛋白质的三级结构预测显示,大别山牛占优势的单倍型三级结构突变区域所在的α螺旋部分或完全脱离原折叠区域。综上所述,本研究证实皖东黄牛与大别山牛可形成独立分支,支持普通牛的多中心演化学说。鉴定出ANXA1、ETS1和KLF2基因表达量与两种牛种质差异相关,PSPC1基因表达量与生长性状体长相关。编码变异位点的基因水平富集分析发现PPCP为两种牛的种质差异相关基因。
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