研究背景肠球菌属(Enterococcus)细菌广泛分布于土壤、水和食物中,既往认为肠球菌是对人类无害的共栖菌,现已证实肠球菌可引起多种危及生命的感染。近年来,由肠球菌引起的医院感染逐年增加,已成为医院内感染的重要病原菌之一。临床感染以粪肠球菌占优势,约占85%～95%;其次为屎肠球菌,约占5%～10%,屎肠球菌引起的感染有增加趋势:其余少数为坚韧肠球菌和其它肠球菌,仅占5%以下。肠球菌对现有的大多数抗菌药物天然耐药(如青霉素类、头孢类抗菌药物),使其不易从感染部位清除;此外,肠球菌还可通过基因突变、质粒转移或转座子等方式获得耐药性。致病力的增强是近年来肠球菌发病率上升的另外一个原因。有研究认为肠球菌也可通过水平转移等方式获得外源性的毒力基因,使其毒力增强,致病能力提高,这种致病基因还可进一步在种属之间进行传播。致病岛(pathogenicity island,PAI)编码多种毒力因子,一般只存在于致病株中,而不存在于非致病菌。致病岛的发现,极大地改变了人们对细菌毒力进化的认识。2002年,Shankar等在临床致病粪肠球菌中鉴定出第一个肠球菌致病岛,该岛大约150kb大小,携带致病所需基因,以及一些可能与致病有关、不存在于非感染菌株的潜在毒力基因。目前,国外对肠球菌致病性的研究较多,而国内则较少。由于细菌的进化与所处环境有着非常密切的关系,所以不同地区的菌株会有着自身的特点,只有掌握本土菌株的致病性、耐药性以及其种群特点等方面的信息,才能有效地控制肠球菌的感染、传播以及毒力和耐药基因的扩散。研究目的了解广州地区粪肠球菌和屎肠球菌的耐药特征、可能携带的毒力基因和致病岛相关基因及其频率;比较临床菌株和健康人肠道携带的粪肠球菌和屎肠球菌在上述方面的差异;通过10株粪肠球菌的多位点序列分型(multilocus sequencetyping,MLST)分析结果,初步了解广州分离菌株的遗传背景,为进一步开展粪肠球菌的种群研究奠定基础。研究方法1.菌株本研究的肠球菌共155株(粪肠球菌103株,屎肠球菌52株)。155株菌株中,医院来源的菌株为100株(粪肠球菌55株,屎肠球菌45株),来自于广州三家医院;健康人肠球菌55株(粪肠球菌48株,屎肠球菌7株)。2.方法(1)采用细菌学方法分离、鉴定广州地区医院及健康人所携带的肠球菌;(2)按照NCCLS推荐的K-B法检测粪肠球菌和屎肠球菌对红霉素(ERY)、氨苄西林(AMP)、氯霉素(CHL)、四环素(TCY)、高单位庆大霉素(GEH)、万古霉素(VAN)、替考拉宁(TEC)的敏感性;(3)采用PCR方法检测所收集菌株的常见毒力基因efaA、gelE、esp、cylA、ace和agg,了解各基因的频率及分布特征;(4)采用PCR和斑点杂交方法检测粪肠球菌PAI相关基因nuc、cylB、esp、hyd、psaA和gls24-like,比较不同类型和不同来源菌株所携带的PAI相关基因情况;(5)采用多位点序列分型法(MIST)测定10株粪肠球菌7种看家基因gdh、gyd、pstS、gki、xpt、aroE、yqiL的基因序列,将其结果按MLST方法进行分类,与相应数据库进行比较,获得广州地区菌株的序列型(ST),并与国际相应资料进行比较。结果1.肠球菌的耐药性检测药敏试验表明,两种肠球菌对7菌抗菌药物具有不同的耐药谱。屎肠球菌中有88.37%对青霉素素产生耐药性,粪肠球菌中该比例只有2.63%。屎肠球菌对高单位庆大霉素、红霉素、四环素和氯霉素的耐药率依次为69.77%,93.02%,37.21%,9.30%,粪肠球菌的耐药率则分别为36.84%,71.05%,77.63%和40.79%。对万古霉素和替考拉宁的耐药率则非常低,仅有4株(9.30%)耐万古霉素屎肠球菌(VRE),其中2株(4.65%)同时耐替考拉宁;在临床来源和健康人来源的粪肠球菌中未发现耐药性之间的差异。肠球菌的多重耐药情况较为严重,超过一半的菌株对3种及以上抗菌药物耐药,屎肠球菌多药耐药率高于粪肠球菌。同时耐受红霉素、四环素和氯霉素是粪肠球菌中最常见的耐药谱型,屎肠球菌中则大多同时耐受红霉素、氨苄西林和高单位庆大霉素。2.粪肠球菌和屎肠球菌常见毒力因子的检测毒力基因检测结果显示,6个基因广泛分布于肠球菌中,各基因阳性率由高到低依次为esp(49.68%)、agg(45.16%)、cylA(37.42%)、ace(32.26%)、gelE(27.74%)和efaA(27.74%)。155株肠球菌分离株中有113株至少携带一种毒力基因,所占比例为72.90%。粪肠球菌和屎肠球菌携带的毒力基因数目和种类不同,前者上述基因的阳性率分别为48.54%、61.17%、49.51%、46.60%、39.81%、37.86%,后者则为51.92%、13.46%、13.46%、3.85%、3.85%、7.69%;除esp基因外,其它5个基因的阳性率在两种菌中的差异均具有统计学意义(P=0.000):此外,携带2种以上毒力基因的粪肠球菌占65.05%,屎肠球菌比例仅为17.31%。对不同来源粪肠球菌进行比较,发现临床分离株的毒力基因阳性率高于健康人分离株,除了cylA和efaA基因,其余4个基因的阳性率均具有统计学差异(P=0.000);两种来源粪肠球菌携带的毒力基因数目也不同,85.45%的临床分离株同时含2种以上毒力基因,其中4或5个基因最为常见;健康人分离株中只有41.67%携带2种以上毒力基因。3.粪肠球菌PAI基因在粪肠球菌和屎肠球菌中的分布特征选择了粪肠球菌致病岛上6个功能上不相关、结构上散在分布的基因作为研究致病岛的标志,检测结果显示各基因阳性率由高至低依次为hyd(81.94%),psaA(78.06%)、esp(53.55%)、cylB(52.90%)、nuc(45.81%)和gls24-like(38.06%):esp基因在两种肠球菌中检出率相同,其它5个基因则是粪肠球菌高于屎肠球菌,其中nuc、cylB、gls24-like具有统计学差异。在粪肠球菌中,6种基因的阳性率均是临床分离株高于健康人分离株,结果如下:nuc(83.64%vs 39.56%);cylB(87.27%vs 45.83%);esp(61.82%vs 39.58%);hyd(94.55%vs 75.0%);psaS(92.73%vs 70.83%);gls24-like(74.55%vs 25.0%),差异均具有统计学意义。完整结构的致病岛大多出现在临床分离的粪肠球菌中,占该部分菌株的52.83%(28/53),在屎肠球菌和健康人粪肠球菌分离株中的比例分别为4.79%(2/42)和28.05%(11/39)。4.10株粪肠球菌的多位点序列分型研究在各种细菌分型方法中,MLST技术具有客观、准确的特点,是目前最为常用的方法之一。采用该方法分析了10株不同来源粪肠球菌的遗传背景。根据获得的数据,发现这10株菌可被分成6个序列型(sequence typing,ST),有4株菌同属于ST16,2株同属于ST4,3株菌分别为ST59,ST67,ST116,1株不能与库中数据匹配,可能为新的ST。结论1.粪肠球菌和屎肠球菌对7种常用抗菌药物具有不同程度的耐药,许多菌株耐受多种抗菌药物,粪肠球菌和屎肠球菌的耐药谱不同,后者耐药率和多重耐药率均高于前者,此结果与其它类似研究的结果相同。提示在临床治疗时进行菌种鉴定、有针对性地使用抗菌药物是非常必要的,万古霉素和替考拉宁是治疗该类感染的首选药。值得注意的是此次研究中也检出了耐万古霉素和替考拉宁的菌株,提醒我们要加强此类菌株的监测,以便尽可能早地发现耐药菌株,防止其传播和扩散。2.粪肠球菌和屎肠球菌携带的毒力基因存在较大差异,前者的毒力基因阳性率明显高于后者,并且表现为多基因携带,含2种及以上基因的菌株很普遍。说明两种肠球菌在环境适应性和致病能力方面存在较大差异,可能具有不同的致病机制;屎肠球菌引起的感染近年呈上升趋势,毒力基因的获得是否使其致病性发生某种变化尚需进一步研究。3.大小不同、结构不一的致病岛元件分布于93.55%的肠球菌中,说明PAI的可塑性非常强,至于其基因丢失的频率和可能的丢失机制,以及是否存在特定的丢失区域目前尚不清楚,需进一步研究。从结构上来说,临床分离粪肠球菌致病岛结构相对完整,健康人粪肠球菌和屎肠球菌则缺失较多,提示致病岛基因可能参与了粪肠球菌的致病过程。4.不同来源(健康人分离株、临床分离株)粪肠球菌对7种抗菌药物的耐药性未发现明显差异,但是二者所携带的毒力基因和PAI相关基因具有较大差异,一方面可能受到样本量的影响,另一方面也提示影响粪肠球菌临床感染率的主要因素可能是毒力大小。5.10株粪肠球菌的MLST研究表明各菌株之间的亲缘关系较远,该结果只是初步了解了广州地区粪肠球菌分离株的ST型,相关研究数据还需进一步积累。