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核黄素是一种B族维生素（VB2），作为临床药品、食品和饲料添加剂，具有广泛的应用。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有从无到有的核黄素合成途径，经过遗传改造的菌株，能够过量合成核黄素。枯草芽孢杆菌作为核黄素发酵生产菌，已成功的应用于工业生产。目前使用的核黄素生产菌株，或多或少带有因诱变剂处理而形成的基因突变。某些未知的基因突变对菌种性能产生了不利影响，主要表现为生长延迟、生物量低等。诱变育种虽可获得核黄素高产菌株，但不能揭示核黄素的高产机理。本研究采用基因工程育种方法，对枯草芽孢杆菌的嘌呤核苷酸合成途径及核黄素转化反应相关的基因进行了遗传修饰，并考察了对核黄素过量合成的影响。以核黄素操纵子组成型表达菌株枯草芽孢杆菌LX20为出发菌，采用无标记基因修饰方法，敲除鸟苷单磷酸（GMP）还原酶基因（guaC），切断由GMP到次黄嘌呤核苷单磷酸（IMP）的逆反应，构建了重组菌株LX21。在此基础上，敲除腺苷琥珀酸合成酶基因（purA），切断由IMP合成腺苷单磷酸（AMP）的分支代谢途径，构建了guaC和purA双缺陷的重组菌株LX22。在菌株LX22中敲除嘌呤操纵子（pur operon）阻遏蛋白编码基因簇purR-yabJ，构建了pur操纵子转录起始去调控的重组菌株LX34。在菌株LX21中，采用同源重组方法，用氯霉素抗性基因替换pur操纵子的mRNA前导区，构建了pur操纵子缺陷的菌株LX23。再通过同源重组方式，用cryⅢA mRNA稳定子替换氯霉素抗性基因，恢复pur操纵子的功能，构建了菌株LX33。再敲除LX33菌株的purA和purR-yabJ，构建了菌株LX35。采用荧光定量PCR方法，检测胞内pur操纵子的mRNA相对水平。结果显示，菌株LX34较LX22平均提高了10.18倍；菌株LX35较LX22平均提高了53.33倍。结果表明，在枯草芽孢杆菌中，敲除purR-yabJ基因簇，同时用cryⅢA mRNA稳定子替换mRNA前导区，能够显著提高pur操纵子转录水平。分别在菌株LX22、LX34和LX35的ribC基因启动子-35区第一个碱基引入“T→C”突变，构建了菌株LX24、LX36和LX37。荧光定量PCR的分析结果显示，ribC基因启动子点突变使其转录水平下降到野生型的3%。摇瓶培养显示，purA、guaC、purR-yabJ和ribC基因的遗传修饰，不影响细胞的生长；嘌呤操纵子的组成型表达，导致菌株的生长延迟。ribC基因启动子点突变仅使核黄素产量提高约3倍，达到160mg/L。结果表明，仅减低ribC基因的表达水平，不足以充分限制核黄素的转化，不能替代编码序列点突变的效应。在ribC基因启动子点突变背景下，嘌呤操纵子组成型表达对核黄素合成的影响不能体现。