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目的：非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s lymphoma, NHL)是免疫系统最常见的恶性肿瘤,并且其发病率和死亡率逐年上升。人淋巴细胞分化抗原CD20是特异性表达于NHL患者B细胞的跨膜蛋白,在正常组织中不表达。因此,CD20是B细胞淋巴瘤治疗的理想靶抗原。本课题的目的是构建抗CD20嵌合抗体真核表达载体,采用定点整合技术,使其在定点整合细胞株FRTCHO中表达,通过检测抗CD20单抗的表达及其生物学活性,筛选稳定、高表达抗CD20单抗CHO细胞株,为大规模工业化生产奠定基础。方法：(1)嵌合抗CD20单抗真核表达载体的构建：分别以32#-2, BF27-L, BF27-H质粒为模板,PCR扩增出目的片段sp163-Lv, κC-κT-CMV, sp163-Hv, Hc-Fc;通过overlapPCR将目的片段连接形成sp163-Lv-KC-KT-CMV和sp163-Hv-Hc-Fc。经HindⅢ、EcoRV双酶切sp163-Lv-κC-κT-CMV,将其定向克隆到真核表达载体pcDNA5/FRT中,构建出pcDNA5/FRT-sp163-Lv-κC-κT-CMV。sp163-Hv-Hc-Fc经EcoR V、Xho I双酶切,然后定向克隆到验证为阳性的pcDNA5/FRT-sp 163-Lv-κC-κT-CMV载体中,经过鉴定得到阳性重组子pcDNA5/FRT-sp 163-Lv-κC-κT-CMV-sp 163-Hv-Hc-Fc.(2)定点整合FRTCHO细胞株的构建：线性化pFRT/lacZeo-dhfr质粒在阳离子脂质体介导下,转染CHO/dhfr细胞,然后用Zeocin抗生素筛选抗性细胞株,通过β-Gal检测试剂盒筛选β-半乳糖苷酶表达量较高的细胞克隆。MTX梯度加压,β-Gal检测筛选β-半乳糖苷酶表达水平最高的定点整合单克隆细胞株FRTCHO。(3)稳定、高表达抗CD20单抗CHO细胞株的构建：将阳性重组表达载体pcDNA5/FRT-sp163-Lv-KC-KT-CMV-sp163-Hv-Hc-Fc与pOG44载体(按照1：9的比例混合后),在阳离子脂质体介导下共转染FRTCHO工程细胞,用潮霉素B筛选抗性细胞株,通过Elisa初步筛选目的蛋白表达量较高的抗性克隆,然后进行Zeocin致敏试验,MT X梯度加压,Elisa检测筛选目的蛋白表达量最高的定点整合表达抗CD20单抗的细胞克隆CHO-CD20,再经无血清驯化培养得到悬浮工程细胞株,放大培养,采用ProteinA亲和层析柱纯化上清,紫外吸收法检测蛋白表达量。(4)目的蛋白的质量研究：采用SDS-PAGE和SEC-HPLC鉴定目的蛋白的分子量和纯度,最后采用活细胞间接免疫荧光法(FACS)口CDC法分析检测表达产物的生物学功能。结果：(1)本课题采用PCR和overlapPCR技术成功获得目的基因片段,并借助定向克隆技术,成功构建pcDNA5/FRT-sp163-Lv-KC-KT-CMV-sp163-Hv-Hc-Fc定点整合真核表达载体。(2)线性化pFRT/lacZeo-dhfr质粒转染CHO/dhfr细胞后,经Zeocin抗生素筛选,β-Gal检测试剂盒检测各孔β-半乳糖苷酶表达量,其中编号为12的细胞孔β-半乳糖苷酶表达量最高,对该孔细胞经过有限稀释法得到20个单克隆细胞株,然后进行MTX梯度加压,通过检测β-半乳糖苷酶表达水平,发现经过500nM加压后,12-A15的β-半乳糖昔酶的表达水平最高,因此,选用12-A15细胞株进行工程细胞构建实验。(3)载体pcDNA5/FRT-sp163-Lv-κC-κT-CMV-sp163-Hv-Hc-Fc与pOG44共转染FRTCHO工程细胞后,经潮霉素B筛选,Elisa检测各孔目的蛋白表达量,其中编号为CD9的细胞孔目的蛋白表达量最高,然后经过有限稀释法培养得到31个单克隆细胞株,Elisa检测目的蛋白表达量,得到5株蛋白表达量较高的定点整合表达抗CD20单抗的细胞株CHO-CD20,分别为CD9-6, CD9-11, CD9-17, CD9-20, CD9-27。经过Zeocin致敏试验,然后进行MTX梯度加压,Elisa筛选,最终得到编号为CD9-17的目的蛋白表达量最高,达到155mg/ml。经过无血清驯化放大培养,ProteinA亲和层析柱纯化上清,洗脱后紫外分光光度法检测得到蛋白表达量为113mg/ml。(4)经过SDS-PAGE电泳得到目的蛋白分子量非还原条件下约为150kDa,还原条件下重链和轻链分别约为50kDa和27kDa；SEC-HPLC检测目的蛋白纯度达到96%；FACS检测表达抗体的抗原结合能力与对照品基本一致；CDC法检测得到目的抗体的半数有效浓度EC50值为2388ng/ml。结论：本课题构建的工程细胞CHO-CD20稳定、高表达抗CD20单抗,以CD20为靶抗原,能够有效杀伤CD20+的B淋巴细胞,为B淋巴细胞瘤的免疫治疗和靶向治疗提供了可行的治疗方案。