论文部分内容阅读
肠出血性大肠杆菌(EHEC)是腹泻性大肠杆菌中重要的一类,属于人畜共患病原菌。主要引起人的出血性肠炎。其中0157：H7是它的一个重要的血清型,在全世界众多散发或暴发流行的腹泻病例中经常涉及到。EHEC O157:H7主要是通过污染食物被人类食用后引发感染,属于食源性致病菌。并且少量的活菌就能导致EHEC O157:H7的感染,使得疾病发生的危险高于其他病原菌。因此,加强EHEC O157:H7的检测极为重要。而传统的细菌分离鉴定方法耗时长,操作繁琐。其他的一些实验室检测方法对仪器设备及操作人员都有一定的要求,不适用于基层检测及大批量样品的筛查。本研究利用两株特异性的单克隆抗体,结合胶体金免疫层析技术,以建立一种灵敏、特异、快速、简便的EHEC O157:H7检测方法。1. EHEC O157:H7单克隆抗体的筛选利用相加ELISA试验对实验室制备的8株针对EHEC O157:H7菌体抗原的单克隆抗体进行筛选,挑选出抗原识别表位影响最小的两株单抗1H3、6F4。其中1H3为IgG,6F4为IgM。对6F4进行辣根过氧化物酶标记,对1H3和HRP-6F4进行竞争ELISA试验,证明两株单抗之间抗原识别表位基本无影响,而两株单抗的效价均在1×105以上,可以用于制备双抗夹心法的胶体金试纸条。2.1H3、6F4杂交瘤细胞株的复苏及单克隆抗体的生产制备对两株杂交瘤细胞株进行复苏,注射杂交瘤细胞于BALB/c小鼠腹腔,进行单克隆抗体的生产。使用辛酸硫酸铵沉淀法对1H3进行纯化,对6F4进行硫酸铵粗提以及Sephadex G-200过柱纯化,纯化后的SDS-PAGE结果显示,两株单抗的杂带很少,纯度较高。1H3纯化后浓度为2.58mg/mL,6F4为1.00mg/mL。3.胶体金免疫试纸条的研制以1H3作为胶体金标记抗体,标记后喷涂于玻璃纤维膜上,涂布量为20.0μL/mL;以6F4为捕获抗体包被于硝酸纤维素膜上,作为检测线,包被量为1.0μL/cm (1.0mg/mL);再在硝酸纤维素膜后端包被兔抗鼠IgG,作为质控线,包被量为0.5μL/cm (1.0mg/mL)。组装制备胶体金试纸条。利用该试纸条对EHEC0157：H7、11种非0157：H7的大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌进行检测,除EHEC O157:H7在检测线处显示出红色条带,其他菌株均为阴性,表明该试纸条的特异性良好。对EHEC O157:H7纯培养物进行检测,检测下限为1×105CFU/mL。对牛奶以及猪肉样品进行人工污染试验,增菌6h后,灵敏度为10CFU/mL-100CFU/mL。4.胶体金免疫试纸条的初步应用对武汉市鲜肉市场采集的200份猪肉样品进行检测。使用改良EC肉汤增菌12h,100℃水浴30min处理增菌液,对处理后的增菌液进行胶体金试纸条检测,200份样品中检测出1份阳性。同时使用国家标准上规定的常规培养法以及实验室已建立的二重PCR方法进行平行检测,三种方法的符合率为100%。