论文部分内容阅读
MDCK细胞是目前公认的最适合禽流感生产的细胞系之一,由于MDCK贴壁性强较难驯化,限制了其在工业化大生产上的应用。唾液酸转移酶(siat7e)基因是控制细胞贴壁程度的重要基因之一,β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I(st3galI)基因编码的产物能提高宿主细胞对禽流感病毒的敏感性。本文拟通过对MDCK细胞转染siat7e和st3gall基因来获得适应悬浮培养和可产高滴度禽流感病毒的细胞株。本研究从人和鸡的血液样品中克隆得到siat7e基因和st3gall基因,构建pReceiver-siat7e-st3galI重组表达载体。经双酶切、PCR及DNA测序分析,证实重组载体构建成功。将重组表达载体,以150V,5ms的条件,电击转染MDCK细胞后48h显微镜观察可见绿色荧光,表明双基因成功表达。采用两次有限稀释法挑选到32个单细胞克隆,经基因组PCR和RT-PCR鉴定,得到10株双基因均为阳性的B3-1、B3-2、B3-3、C5、D5、S5-1、CV9、CV10、E2、F2单细胞克隆株。建立了检测siat7e基因和st3galI基因的TaqMan探针相对荧光定量PCR方法,并结合流式细胞筛选技术从挑选的10个单细胞克隆中筛选出一株双基因均稳定高表达的MDCK-C5细胞株。将H9N2A株C5代毒接种贴壁的MDCK和MDCK-C5细胞,血凝效价测定结果表明在MDCK-C5细胞上病毒滴度高于MDCK细胞。采用逐渐降低血清浓度的方法悬浮驯化MDCK-C5细胞株,细胞密度可达1.3×106cells/mL,并且细胞活力维持在60%以上。将禽流感H9N2A株C5代毒接种MDCK-C5悬浮细胞后48h收获病毒,病毒含量EID50可达10-5-69/0.1mL,血凝效价可达2-8。本试验成功获得适应悬浮生长和可产高滴度禽流感病毒的MDCK-C5细胞株,为工业化纯悬浮大规模生产奠定了基础。