论文部分内容阅读
线粒体相关内质网膜(Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane,MAMs)作为线粒体与内质网之间的物理偶联,在神经细胞钙转运与自噬过程中发挥重要调节作用。镉作为一种重金属毒物,其神经系统毒性效应已十分明确。本课题组前期研究表明,镉可引起神经细胞内质网应激、钙稳态失衡和自噬。有研究表明,钙转运调节了神经细胞自噬过程,但MAMs介导的镉致神经细胞钙转运能力变化与自噬之间的联系机制尚不明确。本研究以神经细胞株大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)和大鼠大脑皮质神经元为模型,以MAMs为切入点,通过体外试验探究了 MAMs及其介导的钙转运在镉致神经细胞自噬中的作用。1镉对神经细胞MAMs及钙转运的影响为研究镉对神经细胞MAMs和钙转运的影响,以PC12细胞和大鼠大脑皮质神经元为模型,用不同浓度(0μM、2.5 μM、5 μM和10 μM)氯化镉染毒6h或5μM氯化镉染毒不同时间(0 h、2 h、4 h、6 h和12 h)或5 μM氯化镉染毒6 h和12 h后,进行如下试验:①Western blot检测MAMs相关蛋白Mfn2、Grp75和VDAC1表达水平。②激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体-内质网偶联变化,透射电镜(TEM)观察MAMs数量变化。③免疫共沉淀试验(Co-IP)检测MAMs Ca2+通道蛋白Grp75/VDAC1互作变化,激光扫描共聚焦显微镜观察Grp75/VDAC1共定位水平变化。④流式细胞术检测胞浆和线粒体Ca2+水平变化。结果表明,与对照组相比,①不同浓度镉染毒6 h,2.5μM组PC12细胞内Mfn2和Grp75蛋白、大鼠大脑皮质神经元内Mfn2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),5 μM和10μM组两种细胞内Mfn2、Grp75和VDAC1表达水平均显著升高(P<0.05)。5 μM镉染毒不同时间,PC12细胞内仅2h组VDAC1无显著变化(P＞0.05),其余组Mfn2、Grp75和VDAC1蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);大鼠大脑皮质神经元内仅6h组Mfn2、Grp75、VDAC1和12h组Grp75蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。②染毒6h组两种细胞内线粒体-内质网关联程度增加,PC12细胞内MAMs数量增加,染毒12h组线粒体-内质网关联程度减弱。③染毒6h组两种细胞内Grp75/VDAC1共定位水平增加,蛋白互作显著增强(P<0.05),12h组PC12细胞内Grp75/VDAC1共定位水平增加,大鼠大脑皮质神经元内Grp75/VDAC1共定位水平减弱,两种细胞内蛋白互作均无显著变化(P>0.05)。④染毒6h组两种细胞内胞浆、线粒体Ca2+水平均显著上升(P<0.05),12h组PC12细胞内线粒体Ca2+水平和大鼠大脑皮质神经元内胞浆Ca2+水平显著升高(P<0.05)。说明镉可引起神经细胞MAMs和钙转运能力改变。2 MAMs对镉致神经细胞自噬及钙转运能力变化的调控为研究MAMs对镉致神经细胞自噬及钙转运能力变化的调控作用,以PC12细胞和大鼠大脑皮质神经元为模型,用不同浓度(0 μM、2.5 μM、5 μM和10μM)氯化镉染毒6h或5 μM氯化镉染毒不同时间(Oh、2h、4h、6h和12h),或通过Crispr-Cas9和RNA干扰技术敲减MAMs结构蛋白Mfn2后用5 μM氯化镉染毒6 h,进行如下试验:①qRT-PCR检测Mfn2mRNA转录水平,Western blot检测Mfn2表达水平。②TEM观察MAMs数量变化,激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体-内质网偶联变化。③Western blot 检测自噬相关蛋白 ATG7、ATG5、ATG14、Beclin1、p-ATG16L1s278 和 LC3II 表达水平,激光扫描共聚焦显微镜观察LC3/Lamp2共定位水平变化。④Co-IP检测Grp75/VDAC1互作变化,激光扫描共聚焦显微镜观察Grp75/VDAC1共定位水平变化;⑤流式细胞术检测胞浆和线粒体Ca2+水平变化。结果表明,①与空白对照组(Con)或siRNA阴性对照组(NCsiRNA)相比,大鼠大脑皮质神经元Mfn2 mRNA转录水平显著下降(P<0.05),两种细胞Mfn2蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)。②敲减Mfn2可抑制镉引起的PC12细胞MAMs数量增多和两种细胞内线粒体-内质网关联程度增强。③与Con组相比,不同浓度镉染毒6 h,2.5 μM组仅PC12细胞内ATG7和p-ATG16L1s278表达水平显著升高(P<0.05),5 μM组两种细胞内各自噬相关蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),10μM组除大鼠大脑皮质神经元内p-ATG16L1s278和LC3II表达水平无显著变化(P>0.05)外,两种细胞内自噬相关蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。5 μM镉染毒不同时间,2h组仅大鼠大脑皮质神经元内ATG7和p-ATG16L1s278表达水平显著升高(P<0.05),4h组两种细胞内ATG5和ATG14、大鼠大脑皮质神经元内ATG7表达水平均显著升高(P<0.05),6h组两种细胞内ATG7、ATG5、ATG14和LC3II表达水平均显著升高(P<0.05),12 h组PC12细胞内ATG5、Beclin1、p-ATG16L1s278和LC3II、大鼠大脑皮质神经元内ATG7、ATG14、Beclin1、和LC3II表达水平显著升高(P<0.05)。敲减Mfn2可显著抑制镉引起的两种细胞内自噬相关蛋白ATG7、ATG5和LC3II表达水平上升(P<0.05)与LC3/Lamp2共定位水平增加。④敲减Mfn2可显著抑制镉引起的两种细胞内Grp75/VDAC1互作增强(P<0.05)与Grp75/VDAC1共定位水平增加。⑤敲减Mfn2可显著抑制镉引起的两种细胞内胞浆、线粒体Ca2+水平上升(P<0.05)。说明镉可通过MAMs诱导神经细胞自噬和钙转运能力改变。3 MAMs介导的钙转运对镉致神经细胞自噬的调控作用为研究MAMs介导的钙转运对镉致神经细胞自噬的调控作用,以PC12细胞和大鼠大脑皮质神经元为模型,利用不同浓度(0μM、5 μM、10μM、20 μM、40 μM)的线粒体钙单向转运体(MCU)抑制剂钌红(RuR)与镉单独或联合处理两种细胞6 h,或通过Crispr-Cas9和RNA干扰技术敲减Ca2+通道蛋白Grp75后用5 μM氯化镉染毒6 h,进行如下试验:①CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测RuR预处理后线粒体Ca2+水平变化。②qRT-PCR检测Grp75 mRNA转录水平,Western blot检测Grp75蛋白表达水平。③Co-IP检测IP3R1/VDAC1互作变化。④流式细胞术检测线粒体Ca2+水平变化。⑤Western blot检测自噬相关蛋白ATG7、ATG5和LC3II表达水平,激光扫描共聚焦显微镜观察LC3/Lamp2共定位水平、EGFP-RFP-LC3荧光聚点变化。结果表明,①与Con组相比,不同浓度RuR对两种细胞活力无显著影响(P>0.05);5μM、10μM、20 μM、40μM RuR预处理PC12细胞或20μM、40μM预处理大鼠大脑皮质神经元均可显著抑制镉引起的线粒体Ca2+水平上升(P<0.05)。②与Con组或NCsiRNA组相比,大鼠大脑皮质神经元内Grp75 mRNA转录水平显著下降(P<0.05),两种细胞内Grp75蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)。③敲减Grp75可显著抑制两种细胞内IP3R1/VDAC1发生互作(P<0.05)。④敲减Grp75可显著抑制镉引起的两种细胞内线粒体Ca2+水平上升(P<0.05)。⑤RuR预处理或敲减Grp75均可显著抑制镉引起的两种细胞内ATG7、ATG5和LC3II表达水平升高(P<0.05),敲减Grp75可抑制镉引起的LC3/Lamp2共定位水平上升以及EGFP-RFP-LC3自噬荧光增强。说明MAMs介导的钙转运在镉引起的神经细胞自噬中发挥重要调节作用。