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小肠是动物消化道内的重要器官,主要参与机体从外界摄入的营养物质的消化和吸收作用。小肠上皮栖居着大量的黏膜微生物,能够起到重要的屏障功能。高精料日粮可导致反刍动物诱发瘤胃和后肠酸中毒,当未经瘤胃消化的过量的精料进入小肠后,可能会加快小肠中微生物发酵,造成微生物的组成和结构发生改变,影响小肠正常的生理功能。本文首先通过体外发酵的方法研究了小肠微生物对含不同比例精料的日粮的发酵能力,然后基于体外发酵试验的结果,进行了在体试验,探究了高精料日粮对山羊小肠微生物发酵、微生物菌群组成与上皮形态结构的影响,全文分以下三部分。1.体外法研究山羊小肠微生物对含不同比例精料底物的发酵的影响本试验旨在通过体外发酵法,研究山羊小肠微生物对含不同比例精料底物的发酵的影响。试验以山羊空肠末端内容物为接种菌源,根据发酵底物中精料比例的不同,分为干草组A0(底物为全粗料),精粗比为3:7组(A0.3)和精粗比为7:3组(A0.7),每组设5个重复,39℃培养24h后,终止发酵。结果显示:与A0组相比,底物中添加精料显著降低了发酵液的pH值(P<0.001),且随着底物中精料比例的升高呈线性降低效应(P<0.001)。与A0组相比,底物中添加精料(A0.3和A0.7)可显著提高总产气量(P<0.001),且随着底物中精料比例的升高,发酵体系中的总产气量呈线性效应(P<0.001)。与A0组相比,底物中含有精料的培养体系的发酵液中总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸浓度显著升高(P<0.05),同时丙酸所占的百分比和异戊酸百分比显著升高(P<0.05),而乙酸百分比、异丁酸百分比、丁酸百分比和乙丙比显著下降(P<0.05),除异丁酸外,其余指标均随着底物中精料比例的增加呈线性效应(P<0.05),但对戊酸百分比和乳酸含量无显著影响(P>0.05)。结果表明,不同日粮条件下,小肠微生物的发酵模式存在差异,高精料日粮促进了小肠微生物发酵。2.高精料日粮对山羊小肠发酵、肠道结构和微生物菌群数量的影响研究本试验旨在研究高精料日粮对山羊小肠微生物发酵、上皮组织形态及微生物菌群数量的影响。选用12头公山羊,采用随机区组试验设计,将其分为两组,即干草组(只饲喂粗饲料)和高精料组(56.5%精料和43.5%粗饲料混合饲喂),每组6头,试验期为6周,试验结束后屠宰,取小肠内容物、黏膜和上皮组织样品用于相关分析。内容物微生物代谢产物结果发现,与干草组相比,饲喂高精料日粮山羊空肠内容物中总挥发性脂肪酸(P=0.015)、丙酸(P= 0.008)、丁酸(P=0.004)、异丁酸浓度(P=0.035)显著提高,乳酸浓度(P = 0.008)显著下降,但对pH值、乙酸、戊酸、异戊酸浓度及LPS含量无显著性影响(P>0.05)。与干草组相比,饲喂高精料日粮显著提高了回肠内容物的总挥发性脂肪酸(P = 0.007)、丙酸(P=0.013)、丁酸(P=0.008)、戊酸(P<0.001)、乳酸浓度(P=0.008)以及LPS含量(P<0.001),降低了 pH值(P = 0.005),乙酸、异丁酸和异戊酸浓度在两组之间无显著差异(P>0.05)。组织形态学结果显示,与干草组相比,高精料日粮显著提高山羊十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度和隐窝深度(P<0.001);空肠绒毛高度与隐窝深度的比值显著下降(P= 0.024);电镜结果表明,高精料组山羊空肠和回肠紧密连接受到破坏。紧密连接蛋白相关基因定量结果显示,与干草组相比,高精料组山羊空肠黏膜claudin-1(P=0.001)、claudin-4(P= 0.033)、occludin(P<0.001)和 ZO-1(P= 0.010)的表达水平显著下降,同时回肠黏膜claudin-4 = 0.034)、occludin(P=0.033)和 ZO-1(P=0.004)的表达量显著下降。与干草组相比,高精料组山羊回肠黏膜中碱性磷酸酶活性显著提高(P<0.05),但对空肠黏膜中碱性磷酸酶活性无显著影响(P>0.05)。Real-timePCR定量分析表明,与干草组相比,高精料日粮山羊回肠拟杆菌门16SrRNA基因拷贝数显著下降(P= 0.037),厚壁菌门与拟杆菌门细菌数量比值显著提高(P<0.001),但对厚壁菌门细菌基因拷贝数无显著影响(P>0.05);空肠中拟杆菌门基因拷贝数、厚壁菌门基因拷贝数以及厚壁菌门与拟杆菌门细菌数量比值无显著变化(P>0.05)。结果说明,饲喂高精料日粮对山羊回肠上皮组织形态及回肠微生物发酵具有显著影响,对其健康可能有不利影响。3.高精料日粮对山羊空肠和回肠黏膜微生物区系和炎症因子表达的影响研究本试验旨在研究高精料日粮对山羊空肠和回肠黏膜微生物组成以及黏膜炎症因子表达的影响。选用12头公山羊,采用随机区组试验设计,将其分为两组,即干草组(只饲喂粗饲料)和高精料组(56.5%精料和43.5%粗饲料混合饲喂),每组6头,试验期为6周,试验结束后屠宰,取空肠和回肠黏膜样品,提取DNA,通过高通量测序方法来观察微生物菌群的变化;提取黏膜RNA,对炎症因子基因进行定量,每组选用5个样本进行数据分析。结果表明,在本试验中,空肠黏膜微生物中存在19个门,245个属和498个OTUs;回肠黏膜微生物中存在20个门、253个属和447个OTUs。与干草组相比,高精料日粮显著提高了 Stenotrophomonas(P=0.028)、Moraxella(P = 0.009)、Lactobacillus = 0.009)和 Prevotella(P = 0.009)的相对丰度;回肠黏膜样品中Christensenellaceae(P= group0.010)的相对丰度显著降低;饲喂高精料日粮的山羊空肠黏膜中的炎症因子基因IL-1β(P= 0.015)、IL-12(P= 0.013)、IL-10(P=0.025)和IFN-γ(P=0.033)的mRNA的表达水平显著升高,而IL-2(P=0.021)和IL-6(P = 0.009)的表达显著降低;饲喂高精料日粮的山羊回肠黏膜中炎症因子基因IL-(P=0.027)和IFN-γ(P=0.038)的相对mRNA表达量显著升高,IL-1β(P = 0.017)和TNF-a(P = 0.045)的基因表达水平显著降低。以上结果说明,高精料日粮提高了山羊小肠微生物中与淀粉降解相关的细菌和致病菌的丰度,提高了部分炎症因子的表达水平。结果提示,饲喂高精料日粮可影响小肠黏膜微生物组成和结构,诱发局部炎症反应。