食油假单胞菌利用甘油合成PHA与新型PHA嵌合酶构建研究

来源 :辽宁大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:mobydick2000
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聚羟基饱和脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate, PHA)是某些细菌在碳源丰富而氮源匮乏的条件下产生的一种生物聚酯。PHA有着良好的生物可降解性、生物相容性、憎水性以及由不同官能团带来的独特性质,被用作组织工程材料药物缓释材料,是一种有很好发展潜力的生物材料。然而,生物合成PHA时出现的单体组分单一、产率低和成本高等问题,严重制约着PHA的广泛应用,还不能满足各领域对于其的需求。目前,PHA的主要生产方法是微生物发酵,如何降低PHA的生产成本和提高产出率,如何改变PHA组分,进而改变PHA的物理和化学性能,已成为当下研究的热点。研究表明,微生物合成PHA的组分及含量受到底物成分的影响,底物成本占到PHA总生产成本的28-50%,采用廉价底物将在很大程度上降低PHA的生产成本,而生物柴油在生产过程中产生的主要副产物是甘油(粗甘油),利用甘油合成PHA既可以解决生物柴油生产过程中带来的环境污染问题,又可以降低PHA的生产成本。PHA合酶是PHA合成过程中的关键酶,决定着PHA组分中单体的类型和PHA的产率,通过改造PHA合酶实现PHA单体成分的改变和提高产率理论是可行的。基因工程是目前合酶改造中应用最多的技术,其主要是在分子层面上来改变合酶,以期能够改变合酶的单体组成、提高催化活性等。通过融合两个或者更多的PHA酶构建嵌合酶,探究对PHA合酶的分子改造机制已成为许多学者研究的热点。在本研究中,我们主要做了两方面工作:一方面,利用实验室现有的食油假单胞菌进行了其利用甘油和乙酰丙酸混合碳源的发酵研究。既能充分利用在生物柴油生产过程中产生的粗甘油,解决与其相关的一系列环境污染问题,又能通过改变PHA单体成分的含量来改变PHA性能。另一方面,以食油假单胞菌和富氧产碱菌、起皱假单胞菌和恶臭假单胞菌分别为出发菌株,利用SOE PCR技术构建了Ⅰ型PHA嵌合酶和Ⅱ型PHA嵌合酶,以生产含有新组分的PHA。研究结果如下:(1)食油假单胞菌利用甘油发酵培养基的优化。配制一系列含有不同浓度梯度甘油和乙酰丙酸的MS培养基,通过摇瓶发酵和气相色谱(GC)检测分析PHA产量和组分。结果表明,食油假单胞菌可在以甘油和乙酰丙酸为混合碳源的发酵培养基中产生共聚物PHB-PHV,且共聚物中各组分的含量与甘油和乙酰丙酸的浓度有一定关系。(2)Ⅰ型PHA嵌合酶构建研究。富氧产碱菌(Ralstonia eutropha)能够利用多种碳源作为底物生长,且只合成3-羟基丁酸酯(PHB)。食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)能够很好的利用甘油产PHA,但是其生产PHA能力较低。利用在线数据库Predtor、GOR4、SOPMA分别对PhaCpo和PhaCRe的氨基酸预测分析其二级结构,采用生物分析软件Vector NTI 6.0对两个酶进行序列比对,找到二者PHA合酶的最佳嵌合位点。通过SOE PCR技术可以构建得到含有二者合酶基因的嵌合酶基因phaCPoRe,并构建重组菌R. eutropha PHB-4-pBBR1MCS2-phaCPoRe,摇瓶发酵重组菌,收集菌体称重获得CDW,通过GC验证PHA嵌合酶活性。通过与短链以及中长链标准品的气相色检测保留时间对比,可以得知,带有二者嵌合酶基因PhaCPoRe的重组菌R.eutrophaPHB-4-pBBR1MCS2-phaCPoRe,能够利用合适的碳源生长并合成PHA。如:在以甘油、葡萄糖酸钠、果糖为碳源的培养基中,能够很好的生长,只产生PHB,在以月桂酸、辛酸钠为碳源的培养基中可以生长,合成了不同比例的3-HB且产生新的组分3-HO的PHA单体。实验结果说明构建的Ⅰ型PHA嵌合酶具有活性,而且能够利用合适的碳源产PHA。(3)Ⅱ型PHA嵌合酶构建研究。从起皱假单胞菌PHA合酶基因(PhaCpc)和恶臭假单胞菌PHA合酶基因(PhaCpp)出发,利用在线数据库Predtor、GOR4、 SOPMA分别对PhaCpc和PhaCPp的氨基酸预测分析其二级结构,采用生物分析软件Vector NTI 6.0对两个酶进行序列比对,找到二者PHA合酶的最佳嵌合位点。通过SOE PCR技术可以构建得到含有二者合酶基因的嵌合酶基因phaCPcPp,并构建重组菌P. putida GPp 104-pBBR1MCS2-PhaCPcPp,摇瓶发酵重组菌,收集菌体称重获得CDW,通过GC验证PHA嵌合酶活性。通过与短链以及中长链标准品的气相色检测保留时间对比,可以得知,带有二者嵌合酶基因PhaCPcPp的重组菌P. putida GPp 104-pBBR1MCS2-PhaCPcPp,能够利用合适的碳源生长并合成PHA。实验证明,重组菌P. putida GPp 104-pBBR1MCS2-PhaCPcPp能够在合适的碳源中生长,在有些碳源中既能生长,也能产生PHA组分。在以果糖为碳源的培养基中,能够生长且只产3-HDD,在以油酸为碳源的培养基中,能够生长且只产3-HD,在以油酸钠为碳源培养基中,产生了不同比例的3-HD和3-HDD。实验结果说明构建的Ⅱ型PHA嵌合酶是具有活性的,而且能够利用合适的碳源产PHA。综上所述,本研究通过利用食油假单胞菌进行的发酵实验发现:不同比例的甘油和乙酰丙酸影响着共聚物PHB-PHV中各组分的含量。这一发现既可以在一定程度上解决生物柴油副产物过度积累带来的环境问题,又对降低PHA的生产成本具有重要意义。同时,本研究通过构建嵌合酶phaCpoRe和PhaCPcPp的实验证明:新的嵌合酶具有生物学活性,且能利用合适碳源产生新型PHA。这对今后利用基因工程技术构建产新型PHA的嵌合酶提供了理论基础,对改变PHA的单体组成提供了方法,将极大的促进PHA更为广泛的应用。
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