【摘 要】
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用F/2培养液作为培养基,在恒温光照培养箱内用500 mL三角烧瓶培养微绿球藻(Nannochloropsis oculata),控制温度25℃,海水比重为1.020,连续光照,光强70 μmol·m·s微绿球藻生
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用F/2培养液作为培养基,在恒温光照培养箱内用500 mL三角烧瓶培养微绿球藻(Nannochloropsis oculata),控制温度25℃,海水比重为1.020,连续光照,光强70 μmol·m<-2>·s<-1>微绿球藻生长到对数期后离心收集,冷冻干燥后用直接转甲酯法抽提脂肪酸,经气相色谱分析发现该藻富含二十碳五烯酸(EPA)而不含二十二碳六烯酸(DHA).用CTAB法提取对数生长期收集的微绿球藻基因组DNA,所提取的基因组DNA经752型紫外分光光度计检测OD<,260>/OD<,280>值在1.82~1.89之间,琼脂糖凝胶电泳可知大小为23kb左右.超声波处理基因组DNA后大部分分子大小在1.6~3kb之间,经T4DNA聚合酶补平后,用QIAquick胶抽提试剂盒回收,回收后DNA浓度为30ng/μL.超螺旋pUC18 DNA经SmalI酶切、牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去磷酸处理后产生线形质粒DNA的浓度为25ng/μL.将回收后的基因组DNA片段与pUC18/SmalI+CIP连接,形成重组DNA分子.将此DNA分子感染大肠杆菌DH10B感受态细胞,取100μL菌液涂平板,得到大约100个克隆.根据集胞藻(Synechocystis sp.)△6-去饱和酶基因序列,设计两条引物(p1、p2),以基因组DNA为模板进行PCR扩增.结果得到一条大小在900bp左右的扩增条带.PCR产物经QIAquick PCR纯化试剂盒纯化后与pGEM-T载体进行连接,连接产物转化感受态细胞后,涂布LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板,结果形成蓝白斑.随机挑选8个白色克隆,以pGEM-T载体克隆位点两端的通用引物(T<,7>、SP<,6>)进行PCR扩增,结果得到大小在900~1031bp之间的扩增条带.
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