一、研究背景与目的结直肠癌在全球恶性肿瘤的发病率中,男性和女性的发病率分别位居第三位和第二位。目前研究较为广泛的结直肠癌发病基因APC基因,是Wnt/β-catenin信号途径中最为重要的抑癌基因,不仅与家族性结肠腺瘤性息肉病(FAP)有关,而且与散发性大肠癌形成也有密切关系。Dove实验室建立的C57BL/6J-APCMin+小鼠品系,其APC两条链中的第850号密码子发生无义突变,导致APC不能正常行驶功能,从而造成其肠道多发腺瘤,提供了良好的实验模型。同时,大量研究表明改变饮食习惯可使肿瘤病人获益,结直肠癌与饮食因素密切相关,其中多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)成为研究的热点。PUFAs是指含有两个或两个以上不饱和双键的脂肪酸,n-3 PUFAs具有调节心血管功能、抗动脉硬化、抗炎、抗瘤等多种功效。已有研究证实,饮食中脂肪酸的摄入量不均衡是诱发大肠癌的主要危险因素之一,在维持细胞稳态和正常生长过程中起关键作用的并不是n-6 PUFAs和n-3 PUFAs的绝对水平,而是n-6/n-3 PUFAs的比例。近年来发现主要存在于一些低等的植物、微生物和线虫的fat-1基因,它的编码产物是一种n-3脂肪酸去饱和酶,能将n-6 PUFAs转化为n-3 PUFAs。导入fat-1基因的转基因小鼠能表达n-3脂肪酸去饱和酶,具有转换n-6 PUFAs的能力,无需再给小鼠饲喂外源的n-3 PUFAs,排除了由于外源n-3 PUFAs来源和种类的不同对实验结果造成的影响,为研究n-6/n-3 PUFAs的比例改变对机体代谢及病理过程的影响提供了更可靠和直观的模型。雷帕霉素靶蛋白mTOR (the mechanistic target of rapamycin)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,调控细胞生长、代谢、蛋白质翻译、脂类合成、线粒体能量代谢、细胞生长增殖、衰老等多种重要的生理过程。mTOR活性的发挥有赖于它在细胞内与其他分子形成复合物,主要有两种复合物mTORC1(mTOR complex1)和]mTORC2(mTOR complex 2). mTORC1由mTOR, Raptor mLST8和PRAS40组成,细胞接受生长因子及胰岛素等信号刺激后PI3K/Akt被活化,后者能够磷酸化并抑制结节性硬化复合物1/2(tuberous sclerosis complex 1/2, TSC1/2),从而减弱TSC1/2复合物对小G蛋白Rheb的抑制作用,使Rheb处于GTP结合状态,进一步激活mTORC1。雷帕霉素(Rapamycin)可特异性地抑制mTORC1。相对于mTORC1 ,mTORC2的调节机制与功能还很不清楚。mTORC2包括mTOR、mLST8、Rictor、PRR5和mSinl, mTORC2在磷酸化并激活Akt (S473)中起关键作用,并在细胞存活、细胞骨架调节与运动中起调节作用,但其活化机制尚不清楚。近年来的证据表明,mTOR是促进多种肿瘤发生发展的关键因素,其与结直肠癌的发生与发展关系密切,目前约40%大肠癌病人大肠肿瘤标本中观察到mTORC1信号通路的活化。然而,n-3 PUFAs、结直肠癌和mTORC1三者的相互作用尚未见报道。越来越多的临床工作者发现了肠道肿瘤与血脂存在密切关系,Moser等也报道APCMin/+小鼠具有高脂血症,他们发现具有严重贫血的APCMin/+小鼠几乎都伴有高脂血症。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activator receptor,PPAR)是脂肪调节的重要物质。最近有证据表明,mTOR在脂肪组织中PPARγ激活后降血脂和促进脂质合成的过程中都起着关键的调节作用。因此我们选择ApcMin/+小鼠作为结直肠癌的小鼠模型,同时使用可内源性产生n-3 PUFAs的fat-1小鼠,来研究n-3 PUFAs是否通过激活或抑制mTOR来调节结直肠癌及其相关的血脂变化。二、研究方法首先,我们选择ApcMin/+小鼠作为结直肠癌的小鼠模型,同时使用可内源性产生n-3 PUFAs的fat-1小鼠,观察内源性的n-3 PUFAs对肠道腺瘤的作用、对血脂的作用及对mTORC1通路活性的影响。其次,我们对结直肠癌细胞进行各种生长因子的刺激(胰岛素、花生四烯酸和氨基酸),同时加入DHA/the fat-1 cDNA,观察DHA/the fat-1 cDNA对mTORCl活性的影响。同时观察DHA对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响。再次,我们对正常结肠上皮细胞及前脂肪细胞进行处理(Apc-SiRNA和theFat-1 cDNA),观察the fat-1 cDNA对mTORC1通路活性的影响。三、研究结果1、fat-l-ApcMin/+结直肠癌模型鼠中肠道腺瘤减少,mTORCl活性降低。我们将ApcMin/+小鼠与fat-1小鼠交配,产生同时携带有fat-1和ApcMin/+的双重转基因小鼠来研究内源性的n-3 PUFAs对结直肠癌发生的影响。我们发现,fat-1ApcMin/+小鼠体内n-3/n-6的比值显著上升,该小鼠肠道腺瘤数大大减少,肿瘤的体积显著减小。另外,fat-1-ApcMin/+小鼠的腺瘤中p-S6(S235/236)水平显著降低。这些结果说明体内n-3 PUFAs的富积和n-6 PUFAs的减少,以及由此而产生的n-3/n-6比值的增加抑制了mTORC1的活性及结直肠癌的发生,mTORC1参与了内源性n-3 PUFAs抑制结直肠癌发生的过程。2、n-3 PUFAs抑制了结直肠癌细胞中mTORCl的信号通路我们检测了外源及内源性n-3 PUFAs对结直肠癌癌细胞中mTORC1的信号通路的作用。我们发现,在HCT116和SW480细胞中,无论是胰岛素,花生四烯酸(AA)还是氨基酸,它们所诱导的mTORC1下游蛋白S6的磷酸化均能迅速地被DHA/the fat-1 cDNA所抑制,且呈现浓度依赖性。同时,我们在正常结肠上皮细胞NCM460转染APC-SiRNA后,the fat-1 cDNA能抑制mTORCl下游蛋白S6的磷酸化的升高。这些结果表明,mTORC1参与了外源和内源性n-3 PUFAs抑制结直肠癌发生的过程。3、fat-1-ApcMin/+结直肠癌模型鼠血清血脂水平降低,内源性的n-3 PUFAs影响APC-SiRNA干扰的前脂肪细胞的mTORCl表达。fat-1-ApcMin/+小鼠体内血脂水平显著降低,同时我们在前脂肪细胞转染APC-SiRNA后,the fat-1 cDNA能降低能抑制mTORC1下游蛋白S6的磷酸化的升高。这说明n-3/n-6比值的增加抑制了mTOC1的活性,从而有效地改善了结直肠癌相关的高脂血症。四、结论1、外源摄入和内源产生的n-3 PUFAs都能抑制结直肠癌的发生和发展。2、mTORC1信号通路参与外源及内源性n-3 PUFAs抑制结直肠癌的过程。3、本研究的结果为n-3 PUFAs在结直肠癌治疗中的作用提供证据。