背景:白血病(Leukemia)又称“血癌”,其作为一种常见的造血系统恶性疾病,是严重危害人类身体健康的恶性疾病之一。目前白血病的治疗还是以化疗、骨髓移植为主,但多数患者只能获得短暂缓解,最终因复发或耐药而死亡。Thrombospondins中文名血小板反应蛋白,是一个胞外蛋白参与细胞与细胞和细胞矩阵通信的家族。Thrombospondin-1,是一种具有毒性从而促使癌细胞凋亡的蛋白,已有研究结果表明,TSP-1抑制白血病主要的作用部位关键是TSP-1的羧基端4N1。CAR(Coxsackie and adenovirus receptor)为柯萨奇病毒腺病毒受体,它可与5型腺病毒所结合,从而介导5型腺病毒Ad-EGFP有效侵染白血病细胞。本课题立足于肿瘤靶向基因一病毒治疗(Targeting Gene-Virotherapy)的策略,以溶瘤腺病毒为载体,根据thrombospondin-1(TSP-1)羧基端4N1氨基酸序列(RFYVVMWK),以已有的腺病毒受体sCAR为模板,将8个氨基酸序列通过PCR扩增于sCAR之后,得到目的序列sCAR-4N1,连接到表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15后获得工程菌。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-4N1,用于抗白血病的研究。　　 目的及意义:本课题根据白血病细胞表面表达CD47,而正常细胞表面CD47表达量相对较少的特点,将其作为特异性清除白血病细胞的理想靶点。通过原核,表达纯化出能够特异靶向白血病细胞的sCAR-4N1蛋白,该蛋白羧基端可以与白血病细胞表面的CD47整联,以达到靶向并有效侵染白血病细胞的作用。本课题构建的融合蛋白sCAR-4N1,能够抑制白血病细胞增殖,并诱导其凋亡的作用。此外,本课题设计了携带4N1和IL-24两个抑癌基因的5型腺病毒sCAR-4N1-IL-24,根据白血病细胞表面表达CD47,而正常细胞表面不表达CD47的特点,设计并构建了能够特异靶向白血病细胞的溶瘤腺病毒Ad.hCMV-sCAR-4N1-sp-E1A-△E1B-hCMV-IL-24,该病毒期望通过融合蛋白sCAR-4N1、Survivin启动子、IL-24三者的协同作用,清除白血病细胞,以期望达到治愈白血病的目的。　　 方法:一、构建携带融合基因sCAR-4N1的质粒;二、融合蛋白sCAR-4N1原核表达并纯化;三、通过体外细胞实验鉴定蛋白sCAR-4N1杀伤性;四、构建包含两个外源表达框(hCMV-sCAR-4N1和hCMV-IL-24)的穿梭质粒;五、HEK293细胞中通过同源重组包装目的病毒,以用于以后白血病的抗癌效果研究。　　 结果:成功构建含融合基因sCAR-4N1质粒,在大肠杆菌M15中成功表达sCAR-4N1融合蛋白sCAR-4N1。纯化后进行的体外实验表明此蛋白能够达到抑制白血病细胞K562增殖,并诱导其凋亡,且对正常细胞杀伤作用较小。　　 结论:本课题通过原核表达成功纯化的特异性靶向杀灭白血病细胞的融合蛋白sCAR-4N1体外抗白血病效果显著,为治疗基因4N1用于抗白血病的后期研究提供了实验基础。