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目的：腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)是细胞适应环境和营养变化的核心,肝脏是碳水化合物储存和释放最重要的器官。microRNAs (miRNAs)是一组新发现的小分子RNA,几乎可以作用于机体包括能量代谢的各个重要的生命过程。本研究拟筛选小鼠肝细胞中参与AMPK信号传导途径的miRNAs,通过生物信息学方法寻找可能参与AMPK对能量代谢有调控作用的miRNAs,预测其靶基因及可能的生物学功能,并进一步验证其在AMPK调节肝糖代谢中发挥的作用。方法：1.肝细胞AMPK相关miRNAs的筛选：雄性C57BL/6(?)、鼠原代肝细胞体外培养,双丁酰环腺苷酸(dibutyryl-cyclic adenosine monophosphate, Bt2-cAMP)干预作为Bt2-cAMP组,实验组再加入不同浓度(0.125mM、0.25mM、0.5nM、1mM)的5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-B-D-呋喃核糖苷(5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-(3-d-ribofuranoside, AICAR)干预,western blotting方法检测AMPK、环腺苷一磷酸反应元件结合蛋白调节转录共激活子2(cyclic adenosine monophosphate-response element binding protein-regulated transcription coactivator2, CRTC2)蛋白及其磷酸化水平的表达,PCR方法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子la (peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1a, PGC-1α)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphase, G6pase)基因的表达；选择合适的AICAR浓度,Bt2-cAMP组为对照组进行miRNAs芯片检测两组细胞miRNAs谱的差异。2. AMPK相关miRNAs的生物信息学分析：Targetscan网站对芯片结果中变化超过2倍的miRNAs分成上调和下调的两组分别进行靶基因预测,FunDo分析靶基因与疾病的关系。选择在肝脏中表达丰富、AICAR干预后变化显著的miRNA,应用多个靶基因预测网站再次进行靶基因预测,推测其在AMPK对肝糖代谢的调节过程中可能发挥的作用。3. miR-29参与AMPK信号途径对肝糖异生的调节：real time PCR方法检测AICAR干预后miR-29家族、靶基因p85a和糖异生相关基因PEPCK、G6pase的表达；设计构建miR-29家族模拟物,转染小鼠原代肝细胞,转染成功后,PCR方法检测p85α和PEPCK、G6pase基因的表达,western blotting方法检测p85a蛋白的表达；进一步在禁食14h小鼠及正常进食的对照小鼠肝脏中检测miR-29家族、p85a基因和蛋白的表达,观察不同状态下AMPK对miR-29家族及其靶基因的影响。结果：1.肝细胞AMPK相关miRNAs的筛选：Bt2-cAMP干预小鼠肝细胞可明显抑制AMPK和CRTC2的磷酸化水平,增加PGC-1α、PEPCK和G6pase的表达(P<0.01),AICAR干预可促进AMPK和CRTC2的磷酸化,抑制PGC-1α、PEPCK和G6pase的表达(P<0.01)；根据结果,选择AICAR0.5mM作为芯片实验干预的浓度,芯片结果显示变化超过2倍的miRNAs有41种,其中上调的miRNAs有19种。2. AMPK相关miRNAs的生物信息学分析：根据芯片的结果,对变化超过2倍的miRNAs进行靶基因预测,上调的miRNAs预测的靶基因有2456种,下调miRNAs预测的靶基因有3090种；FunDo分析靶基因与疾病的关系,显示上调miRNAs的靶基因相关的疾病32种,下调miRNA的靶基因相关的疾病46种,肝脏相关疾病的前5位分别为癌症、糖尿病、高血压、肥胖和心力衰竭(P<0.01)；寻找芯片结果中含量丰富并且AICAR干预后变化明显的miRNAs,综合多个预测网站和文献的结果,得到pik3rl是miR-29家族的靶基因。3.miR-29参与AMPK信号途径对肝糖异生的调节：AICAR干预下,miR-29家族三个成员的表达均较对照组明显下降,p85a基因表达升高,PEPCK、G6pase基因表达下降(P<0.01)；由于miR-29家族高度同源,且3个家族成员在肝细胞中表达水平及变化趋势接近,构建miR-29家族模拟物,转染小鼠原代肝细胞成功后,p85a基因和蛋白水平表达降低(P<0.05),PEPCK、G6pase基因表达升高(P<0.01)；进一步在禁食小鼠中检测miR-29家族的表达较对照组明显升高、p85a基因和蛋白的表达明显减少(P<0.01)。结论：1. AICAR干预小鼠原代肝细胞可磷酸化激活AMPK及其下游信号传导途径,抑制肝糖异生相关基因的表达,证实了AICAR对AMPK信号途径的激活作用；AICAR干预可影响小鼠原代肝细胞miRNAs谱的表达,有多种miRNAs表达发生明显变化,这些miRNAs可能参与了AMPK信号传导途径的调节：2.生物信息学分析显示,AICAR干预下差异表达的miRNAs可能与癌症和代谢性疾病的发病过程密切相关；3. AICAR干预可明显抑制小鼠原代肝细胞中miR-29家族的表达,p85a作为miR-29的靶基因,参与了AMPK对肝糖异生的调节；AMPK信号途径对肝糖异生的调节可通过miR-29及其靶基因p85a来发挥作用。