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Orexin[又称hypocretin)是在外侧下丘脑区(lateral hypothalamic area, LHA)合成的具有神经兴奋作用的小分子肽。Orexin有两个单体：orexin A和orexin B,它们来自同一基因转录产物—前orexin原的酶解产物,主要通过两个G蛋白偶联受体orexin-1受体(orexin-1 receptor,OX1R)和orexin-2受体(orexin-2 receptor,OX2R)发挥作用。Orexin神经元胞体位于下丘脑侧下及穹窿周围区核团,数量仅约数千个但其纤维及受体分布却十分广泛,又有明显的投射投向多个脑区。中枢orexin系统对觉醒起关键作用：orexin能神经元密集地投向参与睡眠调控的脑区;orexin基因敲除小鼠或其受体基因自发突变后导致发作性睡病样表型包括猝倒和病态快速动眼(rapid eye movement, REM)睡眠。另外,人发作性睡病患者脑脊液及血浆中orexin水平也有降低。LHA的orexin神经元不仅作为觉醒激动系统中的一个结构参与觉醒促进作用,而且还通过对其他觉醒启动系统的统一控制实现睡眠-觉醒的调控。研究发现,在LHA微注射orexin A能够增加Glu释放,并且在LHA注射Glu促进觉醒。尽管如此,与Glu突触传递有关的orexin能神经元激活对睡眠-觉醒的调节机制尚未阐明。腺苷(adenosine, AD)是广泛存在于中枢神经系统细胞内、外的一种小分子物质,属于中枢抑制性递质,具有强烈抑制胆碱能和谷氨酸能神经元的功能。在中枢神经系统有4个G蛋白偶联的AD受体A1R,A2aR,A2bR和A3R,其中A1R,A2aR与睡眠-觉醒状态的调节有关。传统观点认为AD的作用位点主要位于基底前脑,但是最近—项下丘脑脑片的膜片钳实验证明,在外侧下丘脑这个觉醒促进区给外源性AD后,能抑制orexin能神经元的活性。本课题组前期采用脑片膜片钳技术研究发现,内源性AD通过激活其A1R抑制orexin能神经元的兴奋性突触传入。AD为生理性睡眠因子,在外侧下丘脑给予AD受体拟似剂(N6-cyclopentyladenosine, CPA)可诱发睡眠,而给予AD受体选择性的拮抗剂(1,3-dipropyl-8-phenylxanthine, DPX)可以促进觉醒,提示A1R主要参与其中。这些证据表明外侧下丘脑是AD调节睡眠-觉醒周期的另一个重要靶区。尽管如此,A2R是否参与外侧下丘脑区AD对睡眠-觉醒状态的调节以及在体情况下orexin对睡眠稳态因子AD催眠效应的调节尚未有文献报道。本研究采用多导睡眠记录和微注射技术,首先观察与谷氨酸能突触传递有关的orexin能神经元激活对睡眠-觉醒的影响,然后明确AD及其受体对外侧下丘脑orexin能神经元的抑制作用及orexin对睡眠稳态因子AD催眠效应的调节作用。结果如下：1. orexin A对睡眠-觉醒的调节作用外侧下丘脑orexin能神经元区内微量注射orexin A对大鼠睡眠-觉醒周期的影响。在LHA微量注射后的0-3 h内,给予10 pmol orexin A的大鼠觉醒期显著增加到微注射ACSF后的1.28倍,基线对照的1.31倍(P<0.05)；非快速眼动(non-rapid eye movement, NREM)睡眠显著缩短到微注射ACSF后的90%,基线对照的89%(P<0.05)；此时REM睡眠没有明显差异。在给予40 pmol orexin A后的0-3 h内,大鼠的觉醒期显著增加到微注射ACSF后的1.32倍,基线对照的1.35倍,并且NREM睡眠和REM睡眠均显著缩短(P<0.05)。在注射orexin A之前预先在相同位点微量注射SB-334867(OX1R特异性阻断剂)后,orexin A的促觉醒效应被明显抑制,表明OXlR介导了orexin A的作用。2.局部谷氨酸能神经元环路影响orexin A的促觉醒效应与ACSF自身对照相比,在LHA单侧微量注射80 ng Glu后,大鼠的觉醒时间在0～3h内增加到1.39倍,并且NREM睡眠时间减少到79%。而单侧微量注射40 ng Glu引起的睡眠-觉醒变化没有统计学差异。微量注射ACSF/orexin A后,0-3 h内的觉醒时间增加ACSF自身对照的1.36倍,而在给予orexin A之前预先注射Glu NMDA受体拮抗剂D-AP5后,orexin A的促觉醒效应被抑制,大鼠的睡眠-觉醒时间回复到ACSF自身对照水平。3.AD对睡眠-觉醒的调节作用在外侧下丘脑微注射AD 1、10 nmol和20 nmol后的0-3 h内大鼠觉醒时间分别减少到ACSF自身对照的84%、62%和60%；并且在10 nmol和20 nmol的高剂量AD给药后还伴有NREM和REM睡眠的显著增加。在3-6 h内SD大鼠ACSF自身对照和AD给药后的觉醒时间、NREM和REM睡眠时间在统计学上没有显著性差异。与ACSF自身对照相比,在给大鼠外侧下丘脑单侧微注射AD 20 nmol的第1、第2和第3 h内,AD明显减少觉醒时间(P<0.05),分别减少到ACSF自身对照的63%、61%和53%。并且在AD给药后的第5 h大鼠觉醒时间明显降低至ACSF自身对照的78%。此外给予A1R拮抗剂DPX促进大鼠觉醒,而给予A2R拮抗剂3,7-dimethyl-1-propargylxanthine (DMPX)没有类似效应,提示AD通过激活A1R,而不是A2R,发挥促睡眠效应。4. orexin A对AD促睡眠效应的抑制作用与自身对照组比较,在LHA微量注射AD/ACSF后的0-3 h内,大鼠觉醒时间减少到74%,并且NREM和REM睡眠分别增加到1.10、1.40倍(P<0.05)。当微注射AD/orexin A后,觉醒时间、NREM睡眠时间和REM睡眠时间回复到原来水平,与自身对照日没有显著的差异(P>0.05)。在微量注射后的3-6 h内,与自身对照组比较,AD/ACSF和AD/orexin A的觉醒、NREM和REM睡眠的变化差异无统计学意义(P>0.05)。此外,通过比较AD/ACSF和AD/orexin A的睡眠-觉醒调节作用,提示orexin A抑制AD的促睡眠作用。综上所述,本研究结果表明：第一,LHA微注射orexin A促进大鼠觉醒,并且减少NREM和REM睡眠。第二,外侧下丘脑orexin A通过局部谷氨酸能神经元环路发挥其促觉醒效应。第三,LHA微注射AD通过激活A1R,而不是A2R发挥促睡眠效应,并且orexin A能够拮抗其催眠效应。