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目的:药物成瘾作为一种慢性脑疾病,主要特征为失控性的强迫用药和持久的药物渴求。越来越多的证据表明,表观遗传学中非编码RNA在调控药物成瘾中发挥着重要作用。海洛因成瘾作为最常见的阿片类成瘾之一,已成为我国主要的社会公共卫生问题之一。为此,深入研究海洛因成瘾和复吸的神经分子生物学机制,探索与海洛因成瘾的产生和发展过程中密切相关的分子机制具有重要的科学意义和潜在的临床价值。mi RNA是一类非编码RNA,已被证实在神经系统中富集并参与调控大脑的神经可塑性及突触间递质的释放,调控众多涉及神经可塑性和突触功能基因的表达。因此,本研究主要探索mi R-181a在海洛因成瘾和复吸中的表观遗传机制,将为海洛因成瘾诊断和治疗提供生物标志物,并为复吸预防提供新思路和新手段。实验一、依据人体血浆mi RNA表达芯片对人类hsa-mi R-181a表达水平进行验证方法:根据入选和排除标准,收集合格健康对照者(Control,n=49)和海洛因成瘾患者(Heroin addiction,n=53)的血浆样本进行mi RNA表达谱芯片分析。血浆提取RNA进一步通过RT-PCR验证选定的mi RNA表达芯片结果。结果:Control组和Heroin addiction组样本经RT-PCR检测,发现血浆hsami R-181a表达水平Heroin addiction组显著高于Control组中[t(100)=54.956,P<0.001],RT-PCR验证结果与表达芯片基本一致。实验二、依据海洛因自身给药大鼠NAc脑区mi RNA表达芯片对大鼠rnomi R-181a表达水平进行验证方法:SD大鼠行颈静脉插管手术,恢复一周,进行海洛因(0.2mg/ml)自身给药训练,每天4h,持续14天,成功建立海洛因自身给药大鼠稳定模型后,海洛因自身给药大鼠戒断1天和14天后,用条件线索诱导进行海洛因复吸行为测试2h,随机分为戒断1天条件线索诱导组(CS1,n=8),戒断14天条件线索诱导组(CS14,n=8),同时用生理盐水代替海洛因进行大鼠自身给药训练,设立生理盐水对照组(Control,n=7),海洛因自身给药大鼠条件线索诱导测试后麻醉断头取NAc脑区并提取RNA,RT-PCR验证选定的mi RNA芯片结果。结果:经RT-PCR验证,上述三组间的mi R-181a表达水平具有统计学差异[F(2,11)=4.074,P=0.047]。LSD法比较发现,CS1组与Control组相比,mi R-181a表达有增加趋势,但不具有统计学差异(P>0.05),而CS14组与CS1组相比,mi R-181a表达降低,具有统计学差异(P<0.05),同时CS14组与Control组相比,mi R-181a表达有降低趋势,但不具有统计学差异(P>0.05)。实验结果与mi RNAs芯片表达基本一致。实验三:双荧光素酶实验验证rno-mi R-181a对靶基因Me CP2表达的影响方法:根据在线数据库Target Scan预测到mi R-181a与靶基因Me CP2的结合点,构建Me CP2-WT野生质粒与Me CP2-MU突变质粒,分别转染mi R-181a质粒与mi R-181a空载质粒于293T细胞,质粒转染后48h后使用DualLuciferase Reporter Assay System测定各组报告基因的荧光表达量,观察mi RNA对Me CP2是否有直接抑制作用。结果:根据Dual-Luciferase Reporter Assay System测定分析,发现Me CP2基因表达水平在Me CP2-WT+mi R-181a组显著低于Me CP2-WT-NC+mi R-181a组[t(4)=11.480,P=3.28×10-4],同时Me CP2-WT+mi R-181a组显著低于Me CP2-WT+mi R-181a-NC组[t(4)=3.645,P=0.022]。实验结果表明,rno-mi R-181a能与靶基因Me CP2的3’UTR直接结合,并抑制Me CP2基因表达。实验四:检测海洛因自身给药大鼠条件线索诱导复吸后靶基因Me CP2蛋白表达的变化方法:成功建立海洛因自身给药大鼠稳定模型后,随机分为戒断1天条件线索诱导组(CS1,n=8),戒断14天条件线索诱导组(CS14,n=8),并用海洛因条件线索诱导2h后立即麻醉断头取NAc脑区,并用生理盐水代替海洛因设立生理盐水对照组(Control,n=7),用蛋白质印迹法(Western blot)检测Me CP2变化。结果:经Western blot检测分析,Control组、CS1组、CS14组Me CP2蛋白表达具有统计学差异[F(2,6)=34.467,P=5.13×10-4],LSD法比较发现,CS14组与Control组及CS1组相比,CS14组Me CP2蛋白表达均显著升高,差异均具有统计学差异(P<0.05)。实验五:检测海洛因自身给药大鼠NAc脑区过表达rno-mi R-181a后Me CP2m RNA及Me CP2蛋白水平变化方法:成功建立海洛因自身给药大鼠模型,随机分为mi R-181a过表达戒断14天条件线索诱导组(LV-mi R-181a,n=8),rno-mi R-181a阴性病毒戒断14天条件线索诱导组(LV-GFP,n=8),设立戒断14天条件线索诱导对照组(CS14,n=8)。利用脑立体微量注射法对LV-mi R-181a组与LV-GFP组大鼠NAc脑区进行慢病毒注射,病毒在脑内转染2周后进行2h海洛因条件线索诱导复吸测试,然后麻醉断头取NAc脑区。用RT-PCR检测靶基因Me CP2m RNA表达变化,Western blot检测Me CP2蛋白变化。结果:1、经RT-PCR检测靶基因Me CP2m RNA表达变化,LV-mi R-181a组(n=5),LV-GFP组(n=5),CS14组(n=5),经RT-PCR检测,在NAc脑区过表达rno-mi R-181a后靶基因Me CP2m RNA表达降低,但不具有统计学差异[F(2,12)=0.500,P=0.618]。2、经Western blot检测显示,经LV-mi R-181a后,Me CP2表达变化显著降低[F(2,6)=41.008,P=3.17×10-4]。LSD法两两比较发现,LV-mi R-181a组分别与CS14组及LV-GFP组相比表达均降低,且均具有统计学差异(P<0.05)。实验六:观察海洛因自身给药大鼠NAc脑区过表达rno-mi R-181a后条件线索诱导海洛因复吸行为变化方法:成功建立海洛因自身给药大鼠模型,随机分为rno-mi R-181a过表达戒断14天条件线索诱导组(LV-mi R-181a,n=8),rno-mi R-181a阴性病毒戒断14天条件线索诱导组(LV-GFP,n=8),戒断14天条件线索诱导组(CS14,n=8),利用脑立体微量注射法对LV-mi R-181a组与LV-GFP组大鼠NAc脑区进行慢病毒注射,病毒在脑内转染2周后进行2h海洛因条件线索诱导测试。结果:经条件线索诱导2h复吸测试,上述三组间,条件线索诱导复吸行为存在显著差异[F(2,21)=7.559,P=0.03]。LSD法比较发现,LV-mi R-181a组分别与LV-GFP组及CS14组相比,条件线索诱导的复吸行为均显著减低(P<0.05)。实验表明NAc脑区过表达mi R-181a后能显著抑制大鼠条件线索诱导的海洛因复吸行为。实验七:观察海洛因自身给药大鼠NAc脑区注射LV-si RNA-Me CP2后对复吸行为的干预作用及其对基因Me CP2表达的影响方法:成功建立海洛因自身给药大鼠模型后,随机分为LV-si RNA-Me CP2组(n=8),LV-GFP组(n=8),CS14对照组(n=8)。利用脑立体定位微量注射法注射慢病毒,转染2周后进行2h条件线索诱导海洛因复吸行为测试。RTPCR检测Me CP2m RNA表达变化,Western blot验证Me CP2蛋白表达变化。结果:1、经条件线索诱导海洛因复吸行为测试,LV-si RNA-Me CP2组分别与LV-GFP及CS14组相比,条件线索诱导海洛因复吸行为显著减低[F(2,21)=3.851,P=0.038]。2、经RT-PCR检测,发现Me CP2m RNA在各组间存在显著差异[F(2,12)=4.302,P=0.039]。LSD法比较发现,LV-si RNA-Me CP2组分别与LV-GFP及CS14组相比,Me CP2m RNA表达均降低,且具有统计学差异(P<0.05)。3、经Western blot检测,发现Me CP2蛋白表达水平在CS14组(n=3),LV-GFP组(n=3)和LV-si RNA-Me CP2组(n=3)。三组间Me CP2蛋白表达水平存在显著性差异[F(2,6)=43.717,P=2.65×10-4]。LSD法比较发现,LVsi RNA-Me CP2组分别与LV-si RNA-Me CP2组及CS14组相比,Me CP2蛋白表达均显著性降低(P<0.01)。结论:本研究结果显示,外周血浆hsa-mi R-181a水平海洛因成瘾者高于正常人。同时海洛因自身给药大鼠模型中,与生理盐水对照组比较,海洛因成瘾大鼠在戒断1天后NAc脑区mi R-181a有增加趋势,但不具有统计学差异,但在戒断14天后条件线索诱导的海洛因复吸大鼠NAc脑区mi R-181a显著降低(P<0.05)。进一步实验发现,在海洛因自身给药大鼠NAc脑区过表达rno-mi R-181a能显著抑制海洛因自身给药大鼠戒断后线索诱导的海洛因复吸行为,并通过数据库与双荧光素酶实验确认了rno-mi R-181a能直接作用于靶基因Me CP23’UTR而抑制Me CP2基因,同时用LV-si RNA-Me CP2过表达实验进一步证明减少NAc脑区Me CP2蛋白能显著抑制自身给药大鼠戒断后海洛因复吸行为的恢复。综上实验结果所述,初步阐明了非编码mi R-181a调控靶基因Me CP2在海洛因成瘾和复吸中的表观遗传学作用机制,并为临床海洛因成瘾和复吸的预防和治疗提供新的生物标志物和药物靶标。