研究背景:病理性神经痛是由神经系统损伤或功能障碍导致的一种慢性疼痛综合征。发病率高,在临床中很常见,但由于涉及多种病理生理机制,常用的镇痛药物效果往往不理想。慢性病理性神经痛的患者常常伴有情绪紊乱,严重的甚至出现抑郁症状。近些年来,越来越多的抗抑郁药被研究并应用于治疗慢性疼痛综合症。基础和临床研究显示,抗抑郁药在减轻患者疼痛的同时能预防和缓解长期疼痛引发的情绪异常。其中,度洛西汀(5-HT/NE双重重摄取抑制剂类药物)在一些慢性疼痛综合征的临床治疗中得到广泛应用,并且已经获得FDA批准作为某些病理性神经痛的一线治疗药物。而单纯抑制5-HT重摄取的药物并没有表现出较为理想的镇痛效果。基础研究显示,5-HT受体分型较多,不同亚型在疼痛信号传递过程中可能易化或抑制疼痛信号。目前多项研究显示5-HT3受体的拮抗剂具有一定的镇痛作用。沃替西汀是一种临床治疗抑郁症的新药,能够抑制5-HT重吸收,同时激动5-HT1A和5-HT1B受体,拮抗5-HT1D、5-HT3和5-HT7受体。除了和5-HT转运体结合率最高外,沃替西汀与5-HT3受体的结合率较高,和其他受体结合率较低,能够表现出和典型的5-HT3受体拮抗剂昂丹司琼几乎一样的效果。与度洛西汀相比,沃替西汀对慢性疼痛伴发的认知障碍、睡眠障碍等症状均有一定的治疗作用,且安全性高耐受性好,不会导致体重显著增加、性功能障碍或心血管不良反应等副作用。在本研究中,我们采用慢性病理性神经痛动物模型研究了沃替西汀的慢性镇痛作用和对长期疼痛引起抑郁行为的预防作用及相关分子机制。多数研究报导了神经胶质细胞的活化、促炎症细胞因子的增多以及脑源性神经营养因子(BDNF)水平的升高参与了病理性神经痛的发生和维持,同时也涉及了抑郁行为的发生,因而,我们选择从这三方面进行了机制方面的研究,并进一步探讨了5-HT3受体在沃替西汀镇痛和抗抑郁效果中的作用。本文共分四部分内容,主要内容在第二部分和第三部分。研究目的:研究沃替西汀对坐骨神经分支损伤(spared nerve injury,SNI)诱导的慢性病理性神经痛的镇痛效果和预防抑郁行为的作用。并从脊髓腰膨大、前额叶皮质和海马组织中星形胶质细胞和小胶质细胞被激活的情况、促炎症细胞因子的分泌水平和ERK-CREB-BDNF信号通路中ERK、CREB的磷酸化水平以及BDNF的表达水平来探讨沃替西汀对神经痛模型镇痛和抗抑郁作用可能的分子机制。基于沃替西汀除了与5-HT转运体结合抑制5-HT的重吸收以外,还可以拮抗5-HT3受体,且对5-HT3受体表现出较高的结合率,推断其对5-HT3受体的拮抗作用可能是其对SNI模型镇痛和抗抑郁的主要作用机制之一。通过联合应用5-HT3受体的激动剂SR 57227,进一步探讨5-HT3受体在沃替西汀对SNI神经痛模型的镇痛和抗抑郁效果中的作用。研究方法:第一部分实验选用小鼠SNI模型,研究沃替西汀对慢性病理性神经痛的镇痛效果和预防抑郁行为的作用及相关作用机制。以度洛西汀为阳性药物对照组(15mg/kg,i.g),将沃替西汀设置了三个递增剂量组(5mg/kg,10mg/kg和15mg/kg,i.g),另设SNI+溶媒组和假手术组。各组均于右侧坐骨神经分支选择性损伤手术后恢复一周,然后开始灌胃给药,每日一次持续两周。于术前、术后一周给药之前及给药期间(每隔两天)用von Frey monofilament进行疼痛阈值检测。给药两周后进行自主活动和抑郁的行为学检测,然后处死动物取脊髓腰膨大、前额叶皮质和海马组织分别进行分子生物学检测。采用免疫印迹的方法检测了各部位组织中GFAP(星形胶质细胞的标记性蛋白)和Iba-1(小胶质细胞的标记性蛋白)表达水平的变化,TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平的变化,以及ERK-CREB-BDNF通路中p-ERK、p-CREB和BDNF表达水平的变化。用免疫荧光的检测方法,显示了星形胶质细胞和小胶质细胞分别在脊髓腰膨大、前额叶皮质和海马部位的分布多少和细胞形态的改变。第二部分实验同样采用SNI模型,通过联合应用5-HT3受体的激动剂SR 57227,研究5-HT3受体在沃替西汀镇痛和抗抑郁效果中的作用。设置一个实验组于灌胃给予沃替西汀(15mg/kg,i.g)前10分钟腹腔注射5-HT3受体的激动剂SR 57227(10mg/kg,i.p),另设沃替西汀(15mg/kg,i.g)单独给药组,5-HT3受体激动剂SR 57227(10mg/kg,i.p)单独给药组,SNI+溶媒组和假手术组。采用与第一部分实验相同的检测方法进行疼痛阈值检测、抑郁的行为学检测和相关分子生物学检测。研究结果:第一部分实验研究结果显示,与假手术组比,SNI模型鼠术后的机械疼痛阈值明显降低,度洛西汀给药组和沃替西汀给药组随着给药时间均能逐渐升高SNI小鼠的疼痛阈值,且给药两周后行为学检测显示两种药物均能改善抑郁的行为学表现。沃替西汀三个剂量组显示其镇痛和改善抑郁行为学的效果成剂量依赖性。与假手术组相比,SNI模型鼠的脊髓腰膨大、前额叶皮质和海马组织中GFAP和Iba-1的表达均增加,免疫荧光检测结果显示三个部位活化的星形胶质细胞和小胶质细胞分布密度增多,细胞体积增大,突触分支增多。SNI模型鼠三个解剖部位的TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平也均有升高。ERK-CREB-BDNF信号通路的蛋白水平在脊髓腰膨大和前额叶皮质、海马组织的变化有所不同。脊髓腰膨大中p-ERK/ERK、p-CREB/CREB和BDNF均升高,前额叶皮质和海马组织中p-ERK/ERK同样升高,但p-CREB/CREB和BDNF有所降低。经过沃替西汀治疗两周后,以上SNI模型鼠的分子水平和细胞水平的变化均可以得到剂量依赖性地逆转。第二部分实验研究结果显示,在给沃替西汀前10分钟先给予5-HT3受体的激动剂SR 57227降低了沃替西汀对SNI神经痛模型的镇痛作用,同时也抑制了其对慢性疼痛引发抑郁的预防作用。单独应用5-HT3受体的激动剂SR 57227没有镇痛和抗抑郁的作用。从分子和细胞水平上,5-HT3受体激动剂SR 57227抑制了沃替西汀对SNI模型鼠脊髓腰膨大、前额叶皮质和海马组织中星形胶质细胞和小胶质细胞的活化水平,促炎症细胞因子的分泌水平,以及ERK-CREB-BDNF通路中p-ERK、p-CREB和BDNF水平的改变。单独应用5-HT3受体的激动剂SR 57227对脊髓腰膨大、前额叶皮质和海马组织中星形胶质细胞、小胶质细胞的活化、促炎症细胞因子水平和ERK-CREB-BDNF通路蛋白水平没有显著的影响。研究结论:沃替西汀对小鼠SNI慢性病理性神经痛模型具有剂量依赖性的镇痛和抗抑郁的作用。神经损伤后脊髓腰膨大中GFAP和Iba-1表达增多,TNF-α、IL-1β和IL-6分泌增多,p-ERK、p-CREB和BDNF表达增多,参与了神经痛的发生和维持。给予沃替西汀后可以剂量依赖性逆转脊髓水平发生的细胞及分子水平的改变。沃替西汀可能通过调节脊髓神经炎性反应和BDNF水平对SNI模型起到镇痛的作用。前额叶皮质和海马组织中神经炎症反应以及p-CREB/CREB和BDNF减少,可能是神经痛伴发抑郁的机制。沃替西汀能够通过抑制前额叶皮质和海马组织中的神经炎症反应并升高p-CREB/CREB和BDNF的水平同时对SNI模型起到抗抑郁的作用。病理性神经痛和抑郁的发生均有BDNF的参与,但引起BDNF表达改变的机制有所不同。在给沃替西汀前10分钟先给予5-HT3受体的激动剂SR 57227能抑制沃替西汀对SNI小鼠模型的镇痛和抗抑郁效果,拮抗沃替西汀对脊髓腰膨大、前额叶皮质和海马组织中神经炎症反应和BDNF表达的调节作用。沃替西汀对SNI模型的镇痛和抗抑郁作用至少部分是通过其对5-HT3受体的拮抗作用实现的。沃替西汀可能是治疗慢性病理性神经痛特别是伴有抑郁的慢性神经痛的一种新选择。