随着医学技术的发展和医疗水平的提高,肝脏手术在很多医院已常规开展。手术过程中对肝脏血流的阻断可能导致一种常见病理现象--缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)。其概念于1960年首次由Jennings提出,其定义是缺血的组织器官重新获得血液供应后,组织、器官功能并没有得以恢复,其功能代谢障碍及组织结构破坏程度反而加重的现象。缺血再灌注损伤是常见的临床病理现象,涉及机体创伤与失血性休克、心脏冠状动脉缺血、心脏体外循环手术、肝脏部分切除术以及肝、肾脏等器官移植手术等,可严重影响疾病的预后,但由于对IRI发生的分子机制仍然缺乏深刻的研究,限制了临床防治方法的研究及实施。IR损伤的机制复杂,分为缺血及再灌注二个过程；首先,缺血过程中由于缺氧后线粒体功能受损及ATP耗竭,造成能量代谢障碍、钙超载以及细胞凋亡等为主的损伤；其次,再灌注后主要涉及氧自由基释放造成蛋白和核酸的损伤,介导炎症反应及凋亡损伤的进一步加重。另外,由于社会经济水平的提高,以发达国家为主的,包括中国等发展中国家在内的许多国家,肥胖患者越来越多,同时带来的患有包括脂肪肝、高血压、糖尿病等慢性在内的患者也越来越常见,增加了国家卫生开支负担。目前在全球范围内非酒精性脂肪肝已成为一种常见的慢性疾病。我们无论在临床上还是理论研究上都发现,非酒精性脂肪肝患者在肝脏手术或者肝移植手术后发生并发症的概率较高,损伤较严重,且预后较差。肝脏尤其是非酒精性脂肪肝移植过程中,器官的获取和移植过程中产生的IR损伤可导致移植物无功能或功能延迟恢复,并增加移植物急、慢性排斥的发生率,影响移植物的中远期存活率。因此,如何有效的缓解和减轻肝脏,尤其是脂肪肝IR损伤,以及如何更好的保护供体器官,都是急待解决的课题。脂肪肝缺血再灌注损伤的主要机制包括脂质过氧化及炎症因子的分泌增多,从而加重肝脏损伤。脂质的过氧化造成肝脏组织的损伤的同时也可刺激炎性因子的分泌。另外,肝脏内定居的巨噬细胞--Kupffer细胞在脂肪肝缺血再灌注损伤中起到了至关重要的作用。在脂肪肝形成的过程中,Kupffer细胞逐渐被激活,分泌炎症因子造成肝脏损伤,而在IR刺激下,Kupffer细胞进一步地被激活,分泌大量超氧化物、肿瘤坏死因子及细胞因子,从而造成肝脏组织更为严重的损伤。因此,如何能抑制Kupffer细胞的活化,降低Kupffer细胞的活性有效减轻包括脂肪肝在内的肝脏缺血再灌注损伤是我们需要研究的一个重要靶点。肝脏的缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程。包括T细胞等在内的许多免疫细胞及其相关靶点、肝脏实质细胞、炎症介质及缺血预处理等都被用于研究如何减轻肝脏的缺血再灌注损伤。另外,许多药物,包括甲基强的松龙、曲美他嗪、葡萄糖和乌司他丁也被作为药物预处理保护肝脏,减轻缺血再灌注损伤。当然,很多药物的使用及其效果还存在争议,而且它们的使用尚缺乏有效的临床试验,故其临床使用受到了一定的限制。但其作为一种有效的、经济的预处理手段,有进一步研究的意义。红曲黄素作为一种传统的食品染色剂、食品添加剂在包括中国在内的东亚国家已使用近百年。目前对于其研究发现其能有效的减轻肥胖、抑制肿瘤及抑制炎症,具有预防心血管疾病及脂肪肝的作用。另有研究发现红曲黄素能抑制脂肪酸的肠道吸收并增加脂肪酸细胞内的β氧化,从而减少血浆中甘油三酯、胆固醇及游离脂肪酸,改善高脂血症。最近的研究发现,其还能有效减少炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β等的表达。基于以上内容,我们在本课题中研究了红曲黄素与脂肪肝IR之间的相互关系及其对脂肪肝IR损伤调控的可能的相关机制。一、红曲黄素对脂肪肝形成的影响为了探讨红曲黄素对脂肪肝形成的影响,我们构建小鼠脂肪肝模型。为了模仿人类脂肪肝形成过程,我们给予小鼠高脂饮食(60%的能量由脂肪提供)4周,肝脏穿刺病理明确形成脂肪肝模型。取小鼠肝组织苏木精-伊红(HE)染色评价肝脏中脂肪浸润情况。MetaMorph软件分析脂肪肝脂质浸润区域百分比。我们研究发现小鼠喂养红曲黄素后明显减轻了脂肪肝的发生,其脂肪浸润区域比率由31%下降致11%。另外,取小鼠血清检测谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)评价肝脏损伤情况。脂肪肝的形成过程对肝脏功能有所损伤,故脂肪肝形成后可出现ALT明显升高,而红曲黄素的使用能有效的降低血清ALT。这些都说明,红曲黄素的使用能有效的缓解脂肪肝形成,并减轻脂肪肝对肝功能的损害。二、红曲黄素对脂肪肝IR损伤的作用为了进一步探讨红曲黄素对脂肪肝IR损伤的影响,我们采用小鼠部分肝脏IR损伤模型(70%肝组织缺血),观察IR损伤后小鼠肝脏细胞凋亡、脂质过氧化及血清ALT、AST的变化情况。小鼠缺血60分钟后,取再灌注(血流开放)后不同时间点的肝脏组织,我们研究发现小鼠再灌注3小时后其血清ALT及AST的变化达到峰值,故我们选取再灌注3小时作为后续观察时间点。血清ALT、AST的表达用于初步判断及评估IR损伤的程度。我们研究表明从血清ALT、AST指标方面,红曲黄素能明显减轻脂肪肝的IR损伤。肝脏细胞凋亡是另外的一个观察IR损伤的指标。因此我们利用流式细胞仪计算肝脏细胞凋亡率,结果显示在给与高脂饮食小鼠口服红曲黄素后,肝细胞凋亡率及坏死从34.05%下降至13.66%,表明红曲黄素能有效的减少脂肪肝细胞的凋亡及坏死。最后在脂质氧化应激方面,我们采用硫代巴比妥酸反应物法(TBARS)检测肝组织氧化应激水平。同样红曲黄素能有效的降低脂肪肝氧化应激水平。因此从肝酶指标、细胞凋亡及坏死率及氧化应激等方面,我们认为红曲黄素能有效降低脂肪肝的IR损伤。三、红曲黄素对脂肪肝IR损伤后炎症水平的作用为评价脂肪肝IR损伤前后炎症水平的改变,我们从动物实验及体外实验两方面进行评估。首先在动物实验方面,我们采用小鼠部分肝脏IR模型(70%肝组织缺血),观察再灌注3小时小鼠肝组织TNF-α、IL-6及IL-1βmRNA水平。正如预想的一样,红曲黄素能有效的降低上述炎症因子的mRNA水平。我们进一步利用F4/80免疫组化标记IR损伤后肝组织切片内活化的Kupffer细胞数量。我们发现,当小鼠给与口服红曲黄素以后,脂肪肝IR损伤后Kupffer细胞活化的数量明显减少,从而减少了肝脏的炎性损伤。其次在体外实验方面,我们从正常小鼠及高脂饮食脂肪肝小鼠肝脏内分离原代Kupffer细胞。TNF-a刺激原代分离Kupffer细胞,用或不用红曲黄素共培养,并用ELISA法检测上清液中TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白的表达。结果显示红曲黄素能体外水平有效的减少上述炎症因子的蛋白表达。综上所述,红曲黄素作为我们常用的食品添加剂及着色剂,能有效减轻高脂饮食引起的脂肪肝,并能减轻脂肪肝IR损伤后氧化应激、细胞凋亡及坏死、降低Kupffer细胞活性,减少其炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β的表达。本课题首次阐明红曲黄素对脂肪肝IR损伤的保护作用,并初步探讨了其主要机制为抑制Kupffer细胞活性及减少其相关炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1p的表达,具有理论意义及潜在的研究及应用价值。