论文部分内容阅读
大量临床试验表明，核苷类似物具有显著的抗肿瘤、抗病毒活性，如卡培他滨(Capecitabine)、齐多夫定(zidovudine，AZT)、阿糖腺苷(Ara-A)等已广泛应用于临床治疗。用核苷磷酸化酶催化合成具有药用潜力的核苷类似物是近年来研究的热点。在嘌呤核苷与嘧啶核苷相互转化时，因涉及到两种酶的作用，需要同时加入两种工程菌才能实现。因此本研按照究嘌呤核苷磷酸化酶+嘧啶核苷磷酸化酶的模式构建出共表达重组菌，以达到使用单一工程菌即可实现嘌呤核苷与嘧啶核苷之间相互转化的目的。
从大肠杆菌K-12中扩增出嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)基因deoD、尿苷磷酸化酶(UPase)基因udp和胸苷磷酸化酶(TPase)基因deoA，分别克隆到载体 pET-11a和pET-28a中，并转化导入大肠杆菌BL21 (DE3)，构建了四株共表达重组菌。其中两株为双质粒的表达菌株 (DAD 和 DUD)。另外两株为串联表达菌株 (TDA 和 TDU)。在抗性存在的条件下，重组菌质粒稳定性较高。经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE分析可看出，各重组菌株能表达出大量可溶性酶蛋白。经酶活测定分析，各重组菌表达出的核苷磷酸化酶活力相比对照组大肠杆菌宿主菌菌株，均有显著的提高。在对核苷转化能力的测定中，以2，6-二氨基嘌呤(DAP)和胸苷为底物，DAD和TDA菌株催化生成2，6-二氨基嘌呤脱氧核苷(DAPdR)的产率分别达到40.2％和51.8％；以2，6-二氨基嘌呤(DAP)和尿苷为底物，DUD 和 TDU 菌株催化生成2，6-二氨基嘌呤核苷(DAPR)的产率分别达到58.0％和88.2％，均远远高于对照组大肠杆菌菌株。选择串联共表达菌用不同的固定化材料制成固定化菌体，进行重复用。实验表明海藻酸钠固定化的串联共表达菌体催化核苷转化率略高于其他材料固定化的固定化菌体，5次重复反应的转化率平均达到45％左右，且转化率相对稳定。