论文部分内容阅读
目的:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种起源于鼻咽部粘膜的恶性肿瘤。其起病隐蔽、恶性程度高、易发生转移,严重威胁患者的身心健康。大量研究发现癌基因的过度表达是鼻咽癌发生、发展的重要生物因素。近年来,研究发现细胞分裂周期相关蛋白2(Cell Devision Cycle Associated 2,CDCA2)在多种肿瘤中表达上调,且其表达上调与肿瘤的发生、发展及预后有关,但在鼻咽癌中尚未见有报道。本研究主要探讨CDCA2在鼻咽癌中的表达情况及其对鼻咽癌细胞生物学功能的影响。方法:1.应用实时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)和免疫组织化学(immunohistochemistry)技术检测鼻咽癌组织和鼻咽部粘膜慢性炎组织中CDCA2 mRNA和蛋白质的表达水平,分析CDCA2表达与鼻咽癌临床病理特征的关系。2.应用蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测鼻咽癌细胞株HK1、HONE1、5-8F、CNE1、CNE2和CNE2Z细胞中CDCA2蛋白的表达,确定用于后续研究的细胞株。3.利用慢病毒载体介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,敲低HK1、HONE1和5-8F细胞株中的CDCA2表达。将载有CDCA2沉默片段的慢病毒分别转染鼻咽癌细胞株HK1,HONE1和5-8F,建立实验组(HK1-shCDCA2,HONE1-shCDCA2,5-8F-shCDCA2)。转染载有空载片段的慢病毒的细胞作为阴性空载组(HK1-shCtrl,HONE1-shCtrl,5-8F-shCtrl),未作处理的细胞为空白对照组(HK1,HONE1,5-8F)。用荧光显微镜观察慢病毒感染效率,用qRT-PCR和WB法分别检测各组细胞CDCA2 mRNA和蛋白的表达情况,以确定沉默效果。4.采用CCK-8实验和细胞平板克隆形成实验来评价沉默CDCA2对HK1、HONE1和5-8F细胞增殖能力的影响。5.应用细胞划痕实验、Transwell迁移和Transwell侵袭实验来检测CDCA2表达抑制对HK1、HONE1和5-8F细胞迁移及侵袭能力的影响。6.用流式细胞技术检测各组细胞的细胞周期和凋亡情况。7.用WB检测CDCA2是否影响细胞周期相关蛋白的表达。结果:1.16例鼻咽癌组织和16例鼻咽部粘膜慢性炎组织中CDCA2mRNA的相对表达量分别为5.319±3.198,1.148±0.759。相对于鼻咽部粘膜慢性炎组织,鼻咽癌组织中CDCA2 mRNA的相对表达量明显增高,差别具有统计学意义(P<0.001)。CDCA2蛋白在鼻咽癌组织中表达的阳性率为60.47%(52/86),明显高于其在鼻咽部粘膜慢性炎组织中表达的阳性率11.76%(6/51),且其表达与肿瘤局部浸润(P=0.033)、淋巴结转移(P=0.034)有关。2.与CNE1、CNE2和CNE2Z相比,HK1、HONE1及5-8F中CDCA2的基础表达相对较高,因此本研究选择此3株细胞用于后续的体外细胞实验。3.实验组和阴性空载组的慢病毒转染效率均大于90%;与阴性空载组和空白对照组相比,CDCA2 mRNA和蛋白在实验组的表达均明显降低(P<0.001),说明成功构建了CDCA2沉默鼻咽癌细胞稳定株。4.CCK-8实验显示,敲低CDCA2表达后,HK1、HONE1以及5-8F细胞48h后的增殖能力显著降低(P<0.05)。平板克隆形成实验中,HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的克隆形成率分别为(63.733±3.859)%、(63.467±4.601)%和(41.133±2.344)%;HONE1、HONE1-shCtrl和HONE1-shCDCA2的克隆形成率分别为(44.200±3.143)%、(45.667±2.516)%和(35.200±2.553)%;5-8F、5-8F-shCtrl和5-8F-shCDCA2的克隆形成率分别为(64.667±3.113)%、(65.667±2.516)%和(53.267±2.610)%。据此,CDCA2沉默表达后,鼻咽癌细胞克隆形成能力显著降低(P<0.05)。5.沉默CDCA2表达后,未发现鼻咽癌细胞株HK1、HONE1及5-8F细胞的迁移侵袭能力发生显著变化(P>0.05)。6.用流式细胞仪检测细胞周期,实验结果显示HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的G0+G1期细胞比例分别为(62.380±2.868)%、(62.723±1.806)%和(69.507±2.607)%;HONE1、HONE1-shCtrl和HONE1-shCDCA2的G0+G1期细胞比例分别为(33.697±1.825)%、(32.603±2.365)%和(45.320±1.360)%;5-8F、5-8F-shCtrl和5-8F-shCDCA2的G0+G1期细胞比例分别为(62.050±3.080)%、(62.810±2.440)%和(68.373±2.437)%。实验组较阴性空载组和空白对照组G0+G1期的细胞数明显上升,差异有统计学意义(P<0.05),而3株细胞在G2+M期以及S期的变化表现不一。用Annexin V-APC/7-AAD双染料法检测细胞凋亡率,实验结果显示敲低CDCA2后,HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的总凋亡率分别为(7.303±0.702)%、(7.170±0.310)%和(8.967±0.656)%;HONE1、HONE1-shCtrl和HONE1-shCDCA2的总凋亡率分别为(7.040±0.616)%、(6.907±0.708)%和(16.397±1.903)%;5-8F、5-8F-shCtrl和5-8F-shCDCA2的总凋亡率分别为(18.570±1.415)%、(17.883±1.734)%和(23.343±2.270)%。鼻咽癌细胞总凋亡率升高,差别有统计意义(P<0.05)。7.WB显示,CDCA2沉默后,细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)和细胞周期蛋白依赖性激酶6(cyclin dependent kinase 6,CDK6)的表达显著降低,而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21蛋白表达显著增高;细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达无明显变化。结论:1.较鼻咽部粘膜慢性炎组织,CDCA2 mRNA和蛋白在鼻咽癌组织中的表达上调,且其表达上调可能与肿瘤局部浸润及淋巴结转移有关。2.CDCA2可能通过影响鼻咽癌细胞中细胞周期蛋白CDK4、CDK6和p21的表达来调控细胞周期,促进鼻咽癌细胞增殖,同时可能影响细胞凋亡。