背景纳米银广泛应用于纺织品、化妆品及医疗用品等方面,可经皮肤接触、呼吸道、消化道等多种途径进入机体,增加了机体暴露于纳米银的风险。纳米银作为抗菌敷料在临床上创伤表面的应用较多,然而其潜在的应用风险尚存在争议。目的检测低浓度纳米银暴露对大鼠乳鼠皮肤成纤维细胞和神经内分泌细胞增殖及细胞内沉积的影响,为皮肤创伤愈合过程中纳米银的安全应用提供理论参考。方法1.利用组织贴块法分别取大鼠乳鼠背部和尾尖部的皮肤组织,原代培养皮肤成纤维细胞;常规传代培养神经内分泌细胞;用倒置显微镜观察细胞的生长状态。2.MTT法检测不同浓度梯度的纳米银溶液孵育皮肤成纤维细胞(20-10000ng/ml)和神经内分泌细胞(20-5000 ng/ml)后的细胞存活率。3.选用不同终浓度的纳米银溶液分别孵育皮肤成纤维细胞和神经内分泌细胞,在不同的作用时间点,倒置显微镜观察活细胞形态,电子显微镜观察纳米银在皮肤成纤维细胞和神经内分泌细胞内的沉积。4.选用终浓度为20 ng/ml、200 ng/ml、2000 ng/ml的纳米银溶液孵育皮肤成纤维细胞48 h,提取DNA,琼脂糖凝胶电泳检测DNA有无片段化。5.选用终浓度为200 ng/ml、2000 ng/ml的纳米银溶液孵育神经内分泌细胞,在4 h,24 h,48 h时提取蛋白质,Western Blot检测细胞色素C(Cytochrome c)蛋白的表达。6.以上各组均设置正常对照组,即培养细胞未添加纳米银。结果1.光学显微镜下3-5 d可见细胞从皮肤组织块游出,7 d细胞量增多,10 d能贴满培养瓶壁,符合成纤维细胞的一般形态特征。且大鼠乳鼠背部来源和尾尖部来源的皮肤成纤维细胞表达波形蛋白均为阳性。神经内分泌细胞大部分呈圆形,半贴壁状态。2.MTT结果显示当纳米银浓度小于200 ng/ml时,皮肤成纤维细胞的细胞存活率基本不受影响;当纳米银浓度在200-10000 ng/ml时呈现浓度依赖的细胞毒性;纳米银浓度在20-5000 ng/ml时,对神经内分泌细胞的细胞存活率呈时间依赖和浓度依赖性影响。3.不同浓度的纳米银孵育皮肤成纤维细胞的电镜结果显示,当纳米银的终浓度为20 ng/ml和200 ng/ml时,发现少量纳米银颗粒进入细胞质内,且主要沉积在溶酶体内;当纳米银终浓度为2000 ng/ml时,有大量纳米银颗粒进入细胞质内,在微丝、微管、线粒体以及细胞核内发现纳米银颗粒沉积;不同浓度的纳米银孵育神经内分泌细胞的电镜结果,除发现纳米银沉积在细胞质内的不同细胞器外,还观察到细胞凋亡和细胞坏死的现象。琼脂糖凝胶电泳未发现DNA片段化现象。4.2000 ng/ml的纳米银孵育神经内分泌细胞48 h时,Cytochrome c的表达与正常对照组相比,具有显著性差异(P<0.05)。结论1.纳米银抑制皮肤成纤维细胞和神经内分泌细胞的增殖,提示低浓度纳米银在皮肤创伤表面应用时存在安全风险。2.纳米银对神经内分泌细胞增殖的影响可能与经线粒体途径诱导的细胞凋亡通路相关。