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高度致病性、高度传染性的禽流感H5N1病毒的持续传播导致了严重的人类疾病,对人类健康造成了严重的威胁。血凝素(hemagglutinin,HA)是病毒表面参与受体结合、膜融合和病毒侵入宿主细胞的主要膜蛋白,是宿主中和性抗体的主要靶分子。HA与病毒的高致病性密切相关,也是病毒宿主范围的决定因素之一。但是,目前对H5 HA的细胞免疫反应研究较少,这对全面理解禽流感H5N1病毒的免疫防御和免疫病理机制造成了障碍。本文的研究从筛选和鉴定H5 HA蛋白中的细胞毒性淋巴细胞(CTL)表位出发,提供了H5 HA特异性细胞免疫反应的证据。
根据计算机程序预测的结果,我们合成了一系列H5 HA蛋白中的HLA-A*0201限制性的表位.在共复性实验中,这些多肽中有8条被证实能与HLA-A*0201结合,在T2细胞结合实验中,有6条能以高亲和力与细胞表面的HLA-A*0201结合。用带有H5 HA基因的重组痘苗病毒免疫HLA-A2.1/Kb转基因小鼠,再用8条共复性实验中呈阳性的多肽在刺激脾细胞,用酶联斑点(ELISPOT)分析检测发现有两条多肽,RI-10和YV-10能诱导CTL表位特异性反应。用这两条多肽直接免疫HLA-A2.1/Kb转基因小鼠,并用ELISPOT和多肽HLA-A*0201四聚体(tetramer)染色分析检测发现,RI-10诱导很强的CTL表位特异性CD8+T+细胞反应,其诱导的反应强于流感病毒的优势表位GL-9,而YV-10只诱导较弱的CTL表位特异性CD8+T细胞反应。这些结果表明,RI-10是一个能在体内自然加工的,具有很强免疫原性的CTL表位。为了证实转基因小鼠中获得的结果是否适用于人类,我们用tetramer染色分析检测RI-10以及在某些毒株中其第一位氨基酸Arg替换成Lys的变异多肽KI-10能否诱导禽流感病人恢复期外周血单核细胞(PBMCs)产生CTL表位特异性CD8+T细胞反应。结果表明,RI-10和KI-10在两例HLA-A2+的病人的PBMCs中都能诱导CTL表位特异性CD8+T细胞反应。我们进一步解析了分辨率分别为2.3(A)和2.2(A)的RI-10和KI-10与HLA-A2的晶体结构,证实这两个多肽在HLA-A2分子的抗原结合槽中都具有典型的锚定残基和HLA-A2表位结合特性.
通过我们的研究,发现了H5 HA蛋白中两个HLA-A*0201限制性的CTL表位RI-10/KI-10。这些结果为理解禽流感H5N1病毒感染的免疫防御和免疫病理机制提供了线索,并为设计和评价新型禽流感疫苗和诊断试剂提供了思路。